虎杖活性成分治療非酒精性脂肪性肝病的相關信號通路及相互作用

李淑娣， 陳欣菊， 劉江凱， 王 振， 段 飛， 袁卓雅， 梁 磊， 李素領

1 河南中醫藥大學 第一臨床醫學院， 鄭州 450000； 2 河南中醫藥大學第一附屬醫院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以肝細胞脂肪過量堆積為病理特征的慢性肝病[1]，全球患病率高達25.2%[2]。其發病機制尚不清楚，目前被廣泛認可的是“多次打擊”學說，主要認為其發病涉及胰島素抵抗、氧化應激、脂質代謝紊亂、內質網應激及炎癥浸潤等多種潛在途徑及損傷的相互作用[3]，且目前尚無任何治療NAFLD的有效藥物獲批[4]。中藥虎杖為蓼科蓼屬多年生草本植物虎杖的干燥根莖和根，歸肝、膽經，具有活血散瘀、利濕退黃等功效。其主要化學成分包括以大黃素為代表的醌類，以白藜蘆醇、虎杖苷為代表的二苯乙烯類，以槲皮素為代表的黃酮類及其他化合物4類[5]。虎杖具有抗炎、抗氧化、調節代謝、改善微循環、肝保護、抗腫瘤等多種藥理活性[6]。近年來有大量研究[7-10]表明，虎杖活性成分可通過改善胰島素抵抗、抗氧化應激、調節脂質代謝、改善內質網應激、減輕炎癥浸潤等方面發揮對NAFLD的治療作用。本文重點梳理虎杖活性成分治療NAFLD的關鍵信號通路相關研究進展，為進一步闡明虎杖防治NAFLD的分子機制提供理論依據，也為抗NAFLD藥物研發提供思路和參考。

1 虎杖活性成分在NAFLD中調節核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)相關信號通路的機制

1.1 Nrf2相關信號通路在NAFLD中的作用 Nrf2是一種氧化還原反應性轉錄因子，調控一系列抗氧化蛋白表達。Keap1是Nrf2的負調節器，在生理狀態下，Nrf2多存在于胞漿中與Keap1結合，處于被抑制狀態；當受到機體內氧化應激信號刺激后，迅速與Keap1解離，以穩態形式轉入細胞核中，啟動抗氧化反應元件，并與之結合啟動下游多種基因的轉錄與翻譯，從而上調抗氧化物質的表達。氧化應激在NAFLD發生發展中發揮關鍵作用，Nrf2作為機體抗氧化應激的核心途徑之一，調控Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶的表達，清除超氧化物，發揮抗氧化損傷作用[11]。研究[12]發現，Nrf2無效型小鼠相較于野生型小鼠肝甘油三酯升高，Nrf2的缺失加速了非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的進展。另有多項研究[13-14]表明，通過激活Nrf2通路可改善或抑制氧化應激，改善NAFLD和NASH損傷，多種Nrf2通路激活劑在干預NAFLD的實驗中已顯示出積極的效果，Nrf2被認為是防治肝病的關鍵治療靶點。以上研究表明，Nrf2相關信號通路與NAFLD的發生發展密切相關。

1.2 虎杖活性成分在NAFLD中調節Nrf2相關信號通路的機制 氧化應激是指細胞呼吸利用氧產生能量形成三磷酸腺苷時，氧衍生的自由基或ROS的產生及其作用超過對其防御或解毒的能力, 這種細胞氧化還原失調的狀態被稱為氧化應激[15]。槲皮素屬虎杖中活性較高的黃酮類成分具有很強的抗氧化活性，能夠有效減輕肝氧化應激[16]。Panchal等[17]研究發現，槲皮素可使Nrf2表達顯著升高，而上調血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)、肉堿酰基轉移酶(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1)的表達，發揮抗炎、降低氧化應激、調節脂肪酸氧化作用。虎杖苷是從虎杖根中分離出的天然二苯乙烯類化合物，具有抗氧化、抗炎、改善微循環等多種藥理活性[18]。吉秋霞等[7]發現虎杖苷能夠抑制肝臟炎性因子TNFα和IL-6水平，促進Nrf2入核表達，從而提升抗氧化酶活性，減輕肝氧化應激。徐志廣等[8]研究發現，高劑量虎杖苷可降低大鼠的血清TNFα、IL-1β、IL-6以及肝組織脂質過氧化終產物丙二醇(MDA)水平，增加肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性，虎杖苷可通過激活Nrf2/HO-1信號通路，抑制肝臟炎癥及氧化損傷。以上研究提示，虎杖活性成分可通過Nrf2相關信號通路降低炎癥反應、抗氧化應激而發揮治療NAFLD的作用(表1)。

表1 虎杖活性成分調節Nrf2通路作用于NAFLD的效應路徑

2 虎杖活性成分在NAFLD中調節腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated kinase，AMPK)相關信號通路的機制

2.1 AMPK相關信號通路在NAFLD中的作用 AMPK被稱為“細胞能量平衡的感受器”，是體內不可缺少的蛋白激酶，參與多種代謝過程，是細胞內調節糖、脂代謝的關鍵分子[19]。AMPK參與炎癥信號通路的調節，被認為是NAFLD的潛在治療靶點[20]，是改變代謝通路的關鍵能量傳感器[21]。研究[22]表明，AMPK活化后可通過抑制增加脂肪酸氧化、肝臟中脂肪生成和促進脂肪組織中線粒體功能完整性這3種途徑減輕NAFLD的損傷。另有研究[23]發現，激活AMPK/mTOR介導的自噬亦是NAFLD重要的保護機制，當AMPK/mTOR介導的自噬水平顯著提升時，肝毒性可得到緩解，激活AMPK/mTOR介導的自噬是一種新興的NAFLD治療方法。以上研究表明，AMPK相關信號通路與NAFLD密切相關。

2.2 虎杖活性成分在NAFLD中調節AMPK相關信號通路的機制 固醇調節元件結合蛋白1c(SREBP-1c)作為AMPK信號分子的下游蛋白，直接參與調控葡萄糖代謝、脂肪酸和甘油三酯合成相關酶基因的表達[24]。大黃素是虎杖中主要的蒽醌類成分，具有抗炎、改善微循環、保護肝腎、抗癌等藥理活性[25]。大黃素可上調AMPK抑制SREBP-1c及其下游脂肪酸合成相關蛋白的表達，減少肝脂質生成和蓄積，并產生抗氧化應激損傷的作用[26]。胰島素抵抗為NAFLD的首次打擊，在NAFLD的發病過程中發揮重要作用。脂聯素是脂肪細胞因子中與胰島素抵抗關系最緊密的一個特異性細胞因子，是參與胰島素抵抗的重要因素，可增強脂肪細胞的胰島素信號轉導[27-28]。大黃素不僅可激活AMPK，提升脂聯素及其受體的表達，提高胰島素的敏感性[29]；亦可激活AMPK調控的脂聯素促進AMPKα的磷酸化、提高酶活性，從而激活AMPKα下游的過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、SREBP-1c及其靶基因，增強肝細胞脂氧化作用，抑制脂肪酸合成和轉運，減少肝脂聚積[22]。體外研究[30]發現，25 μmol/L大黃素作用24 h后，可抑制分化成熟的肌小管細胞和脂質細胞的氧消耗量，激活AMPK信號通路，增加脂質細胞的糖酵解水平，增加葡萄糖消耗量，改善葡萄糖的代謝。以上研究提示，虎杖活性成分可通過調節AMPK相關信號通路在NAFLD的脂質代謝、葡萄糖代謝、胰島素抵抗等過程中發揮重要作用(表2)。

表2 虎杖活性成分調節AMPK通路作用于NAFLD的效應路徑Table 2 Active ingredients of Polygonum cuspidatumregulates the pathway of AMPK pathway on NAFLD

3 虎杖活性成分在NAFLD中調節NF-κB相關信號通路的機制

3.1 NF-κB相關信號通路在NAFLD中的作用 NF-κB作為一種重要的基因轉錄調節因子，具有多向調節功能，可與多種啟動子結合，參與調控多種炎癥基因、黏附分子和蛋白酶基因的表達[31]。NF-κB的上游分子多種因素激活后，使IκB磷酸化并降解，從而釋放并激活NF-κB，激活的NF-κB移入核內結合到相關基因的NF-κB受體上，調控與炎癥、細胞增殖及凋亡等相關基因的轉錄[32]。NF-κB通路已被證實是炎癥反應和細胞免疫中的重要通路之一，對肝臟的炎癥、氧化應激、肝細胞凋亡和再發生、肝纖維化的過程發揮著重要的作用[33]。以上研究提示，NF-κB相關信號通路與NAFLD在多方面密切相關。

3.2 虎杖活性成分在NAFLD中調節NF-κB相關信號通路的機制 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，也稱為內毒素，引發的慢性低度炎癥被認為是NAFLD進展的關鍵因素。張蓉等[34]發現50 μmol/L大黃素作用4 h可抑制LPS過多引起的肌小管細胞和脂質細胞中NF-κB通路的表達，抑制炎癥因子IL-6、TNFα的分泌，減輕炎癥反應，改善胰島素抵抗。研究[35]發現，大黃素可能通過抑制NF-κB活化，阻斷LPS損傷信號途徑的傳導，從而減緩NAFLD的病理進程。白藜蘆醇是虎杖中非黃酮類多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗老化等功效[36]。研究[37]證實，白藜蘆醇通過抑制NF-κB炎癥通路，減少TNFα、IL-6和IL-1β mRNA的轉錄，從而減少促炎因子TNFα、IL-6和IL-1β的表達，干預了NAFLD發生發展重要環節中的炎癥反應。以上研究表明，虎杖活性成分通過調節NF-κB相關信號通路從減少炎癥反應、改善胰島素抵抗等方面作用于NAFLD(表3)。

表3 虎杖活性成分調節NF-κB通路作用于NAFLD的效應路徑Table 3 Active ingredients of Polygonum cuspidatumregulates the pathway of NF-κB pathway on NAFLD

4 虎杖活性成分在NAFLD中調節沉默信息調節因子1(sirtuin type 1，SIRT1)相關信號通路的機制

4.1 SIRT1相關信號通路在研究NAFLD中的作用 沉默信息調節因子(Sirtuin)是一組高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白和蛋白質脫乙酰酶和ADP-核糖基轉移，SIRT1屬于Sirtuin家族的一員，其活性受NAD水平與AMPK活性的調節，可以使一系列蛋白發生去乙酰化，對蛋白的下游信號分子進行調節，參與能量代謝﹑細胞生存、衰老及凋亡[38]。SIRT1是肝脂質代謝、氧化應激和炎性反應的重要調節因子，可介導與NAFLD發生機制密切相關的胰島素抵抗、內質網應激、脂質過氧化等過程，而改善NAFLD/NASH的損傷[39]。研究[40]表明，SIRT1可通過脂肪合成、脂肪代謝和膽固醇代謝3個方面在NAFLD脂質代謝過程中發揮作用。以上研究表明，SIRT1相關信號通路與NAFLD發生機制中的脂質代謝、氧化應激、炎性反應、胰島素抵抗、內質網應激等多方面密切相關。

4.2 虎杖活性成分在NAFLD中調節SIRT1相關信號通路的機制 脂代謝紊亂所導致的脂肪異位沉積是造成NAFLD的重要原因之一。研究[41]發現，白藜蘆醇能夠在肝臟和脂肪組織中通過SIRT1促進內質網應激蛋白ATF6的去乙酰化和失活化，上調SIRT1的轉錄水平，減少脂滴在肝臟中的蓄積。研究[42]顯示，大黃素可通過促進SIRT1表達，進而促進脂肪細胞對葡萄糖的吸收，改善脂肪細胞糖代謝。白藜蘆醇作為SIRT1的激活劑能夠通過SIRT1介導的信號轉導途徑改善NAFLD[9]。研究[43]表明，白藜蘆醇能夠通過激活SIRT1/腺苷酸活化蛋白激酶信號通路參與細胞的抗氧化反應。Ding等[44]研究發現，白藜蘆醇可調節SIRT1自噬途徑及其下游的進程，減輕內質網壓力、調節肝脂質代謝。以上研究表明，虎杖活性成分可通過SIRT1相關信號通路從調節脂質代謝、改善內質網應激等途徑在NAFLD中發揮作用(表4)。

表4 虎杖活性成分調節SIRT1通路作用于NAFLD的效應路徑Table 4 Active ingredients of Polygonum cuspidatumregulates the pathway of SIRT1 pathway on NAFLD

5 虎杖活性成分在NAFLD中調節PPARα相關信號通路的機制

5.1 PPARα相關信號通路在研究NAFLD中的作用 PPARα是一種配體誘導的轉錄因子，屬于核受體超家族，在能量代謝、肝功能、炎癥、細胞周期改變中起關鍵作用[45]。脂肪酸生成和β-氧化是脂質代謝的2個關鍵環節，PPARα在2個環節均發揮重要作用[46-47]。一方面PPARα可通過調控SREBP-1c表達，通過抑制多種脂肪酸從頭合成基因的表達，抑制肝甘油三酯的合成；另一方面PPARα活化后，會催化β-氧化的限速酶，加速脂肪酸氧化。研究[48]表明，在Kupffer細胞向M1型極化過程中因受到PPARα的調控影響，可進一步改善肝細胞脂肪變性，降低局部炎癥反應。Yu等[49]研究提示，PPARα激動劑可作為潛在治療NAFLD的方法。以上研究表明，PPARα相關信號通路與NAFLD中脂質代謝、炎癥反應等方面密切相關。

5.2 虎杖活性成分在NAFLD中調節PPARα相關信號通路的機制 陳劍明等[50]研究證實，虎杖苷可增強脂質代謝關鍵酶PPARα的合成，改善脂質代謝障礙，減少脂質異位沉積，改善機體氧化應激狀態。吉秋霞等[7]研究顯示，虎杖苷可使肝臟中FASN和SCD1蛋白表達顯著下降，上調PPARα和肉堿棕櫚酰轉移酶1蛋白水平，而發揮調節脂肪酸的新生脂肪生成和β-氧化的作用，減輕血脂異常和肝脂肪變性。研究[10]發現，白藜蘆醇可通過PPARα途徑改善脂質代謝和氧化還原穩態，影響NAFLD的發生發展。以上研究表明，虎杖活性成分可通過PPARα相關信號通路從改善脂質代謝、氧化應激等方面在NAFLD中發揮作用(表5)。

表5 虎杖活性成分調節PPARα通路作用于NAFLD的效應路徑Table 5 Active ingredients of Polygonum cuspidatumregulates the pathway of PPARα pathway on NAFLD

6 信號通路間的相互作用

信號通路是指當細胞要發生某種反應時，信號從細胞外到細胞內傳遞了一種信息，是將細胞外的分子信號經細胞膜傳入細胞內發揮效應的一系列酶促反應通路。在應用虎杖活性成分治療NAFLD的相關通路中，NF-κB是由SIRT1介導的細胞應激反應的轉錄調節因子，SIRT1能夠促進p65/p50復合物結合，使NF-κB轉錄活性失活，抑制其促炎靶基因的表達[51]。SIRT1是AMPK的下游調節蛋白，可通過絲氨酸-蘇氨酸激酶11介導AMPK，增強AMPK的磷酸化，調控脂質代謝[43]。AMPK激活可增加脂聯素的表達，從而激活AMPKα下游的PPARα，增強肝細胞脂氧化作用[22]。Nrf2可通過下調PPARα、PPARγ的表達調控脂質代謝，發揮對肝臟的保護作用[52]。Nrf2可通過轉錄抗氧化劑和相關下游靶基因，下調IL-1、TNFα等促炎因子，減少NF-κB上游激活因子，而下調NF-κB表達[8]，共同調控炎癥反應。由此可見，細胞傳導通路之間是一個復雜的相互作用網絡，虎杖的多成分通過特定的細胞信息作用于多種靶細胞，對應不同靶細胞的受體結合，激活不同的信號傳導通路，發揮相互協同或相互拮抗作用機制，形成相互作用網絡，顯示出從多靶點、多途徑、多層次相互作用的機制特點(圖1)。

圖1 虎杖活性成分治療NAFLD的細胞信號通路機制Figure 1 Mechanism of cell signaling pathway in treatment of NAFLD by active ingredients of Polygonum cuspidatum

7 小結與展望

本研究通過對虎杖活性成分治療NAFLD機制中所涉及到的細胞信號通路予以梳理，發現虎杖活性成分可通過調控Nrf2、AMPK、NF-κB、SIRT1和PPARα等多條相關信號通路，發揮改善胰島素抵抗、抗氧化應激、調節脂質代謝、改善內質網應激、減輕炎癥浸潤等作用，達到防治NAFLD的目的，顯示出多成分、多靶點、多途徑相互作用的機制特點。

目前，虎杖在NAFLD的治療方面取得一定的進展，但虎杖治療NAFLD所涉及的信號通路的相關研究還存在一些局限性：(1)多數研究集中在對虎杖治療NAFLD的經典通路探討，還可挖掘其他重要的信號通路。(2)研究所構建的動物模型比較單一，多屬高脂飲食誘導的模型，可從NAFLD不同發病機制開展模型構建。(3)相關信號通路的相互聯系作用機制研究較少且不深入，可深入剖析探索相關通路間的作用機制。NAFLD發病機制復雜，其疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、NASH、肝硬化和肝細胞癌。可將通路的相互調節、相互拮抗或抑制的作用機制與預防NAFLD疾病譜的進展相聯系，達到更優的防治效果。因此，研究相關信號通路之間的聯系機制，更好的發揮中藥多成分、多靶點、多途徑、多層次的優勢，為虎杖治療NAFLD提供強有力的支撐依據及新的思路將是日后的研究重點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李淑娣負責課題設計，資料分析；陳欣菊、劉江凱、王振、段飛負責修改論文；袁卓雅、梁磊負責歸納總結文獻資料；李素領負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。