超米蘭標準肝細胞癌肝移植術后復發預測模型的建立

張煒琪， 謝 炎,， 陳池義， 賀 健,， 譚玉瑩， 黃亞北， 張 驪， 蔣文濤

1 天津醫科大學一中心臨床學院， 天津 300070； 2 天津市第一中心醫院 肝移植科， 天津 300192

肝細胞癌(HCC)是世界上第六大常見癌癥，并且是腫瘤相關死亡的主要原因之一[1]。肝移植是治療HCC最有效的方法之一，對于符合米蘭標準的患者，肝移植術后5年存活率可達70%[2-3]。但米蘭標準對于患者的要求較為苛刻，為了擴大受益人群，超米蘭標準肝癌肝移植患者的數量逐漸增加，這同時也增加肝移植術后腫瘤復發的風險[4]。

腫瘤復發是患者肝移植術后死亡的常見原因之一，嚴重影響患者預后[4-5]。已有研究[6-8]表明，腫瘤的病理特征以及患者血清甲胎蛋白(AFP)對腫瘤的復發、轉移具有重要提示作用。此外，全身炎癥反應可通過上調細胞因子促進血管生成、DNA損傷和腫瘤侵襲[9-11]，因此中性粒細胞與淋巴細胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio, NLR)作為一種簡單的炎癥指標，與HCC患者肝移植術后復發的聯系也越來越被人們所認可[12-13]。本研究的目的是根據患者術前及術后相關指標建立一個預測超米蘭標準HCC患者肝移植術后復發的模型，用于評估超米蘭標準HCC患者術后復發的風險，以便合理指導治療。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2014年8月—2018年7月在天津市第一中心醫院接受首次原位肝移植的超米蘭標準HCC患者的臨床資料。所有患者術前均根據影像學檢查排除大血管侵犯和遠處轉移，HCC的診斷由術后病理得出。

1.2 納入與排除標準 納入標準：患者年齡在18～70歲；首次原位肝移植；術前未發現遠處轉移及大血管侵犯；術后病理學檢查證實為超米蘭標準的HCC。排除標準：混合性肝癌；多器官聯合移植；術前合并其他部位的腫瘤；臨床及病理資料缺失。

1.3 研究方法

1.3.1 手術和術后管理 所有患者均接受公民逝世后器官捐獻的ABO血型相合的供肝，并由相同經驗的醫師進行原位肝移植。術后采用三聯免疫抑制方案，包括他克莫司 (FK506)、霉酚酸酯(MMF)和激素。術中及術后第4天加用巴利昔單抗20 mg。術后3個月開始加用雷帕霉素并適當將FK506減量，使雷帕霉素和FK506的血藥濃度分別維持在5～8 μg/L和2～3 μg/L，此時密切監測患者血常規、肝功能等指標以早期發現可能的排斥反應，根據患者具體情況決定是否需要加用嗎替麥考酚酯。當發現腫瘤復發時，停用FK506，單用雷帕霉素并使其血藥濃度維持在5～8 μg/L。

1.3.2 病理檢查及免疫組化染色 術后病理檢查及免疫組化染色由兩位病理學專家進行盲法評估。如果兩位病理學專家初始評估不一致，則重新評估結果至達成共識。

1.3.3 隨訪 采用門診或電話方式進行隨訪。術后2年內每2個月隨訪1次，此后每6個月隨訪1次。隨訪期間常規行影像學及檢驗學檢查。當懷疑轉移或復發時，則通過MRI或增強CT進一步評估。主要觀察終點是肝移植術后腫瘤復發。無復發生存時間定義為肝移植至腫瘤復發的時間，對于中途失訪或死亡的患者，則為肝移植至最后一次隨訪的時間。總體生存時間定義為肝移植至患者死亡的時間，對于中途失訪的患者，則為肝移植至最后一次隨訪的時間。隨訪截止日期為2021年7月31日。根據隨訪期間腫瘤是否復發，將患者分為復發組和未復發組。

2 結果

2.1 一般資料 患者基線資料見表1。本研究共納入117例患者，其中男104例，女13例，平均(54.28±9.52)歲，共42例(35.9%)患者在隨訪期間死亡，46例患者中途失訪，中位隨訪時間24(1～74)個月。術后3年生存率為53.1%，術后5年生存率為49.0%。53例(45.3%)患者術后復發，其中52例(98.1%)于術后3年內復發，中位復發時間為6(1～52)個月。其中3例患者在將免疫抑制劑轉為雷帕霉素時肝功能發生輕度異常，經多學科會診討論后考慮輕度排斥反應，在予以加用嗎替麥考酚酯及保肝等對癥治療后，肝功能逐步恢復正常。

2.2 單因素Cox回歸分析結果 患者年齡、腫瘤最大直徑、術前血清AFP、NLR、KLI的最佳截斷值分別為54歲(AUC=0.638，95%CI：0.544～0.725，P=0.007)、5 cm(AUC=0.710，95%CI: 0.619～0.790,P<0.001)、769 ng/mL(AUC=0.726，95%CI：0.636～0.804，P<0.001)、3.75(AUC=0.715，95%CI：0.624～0.795，P<0.001)、0.25(AUC=0.712，95%CI：0.621～0.792，P<0.001)(圖1)。其中MELD評分(AUC=0.507，95%CI:0.413～0.601,P=0.898)對于術后復發的預測能力較差，且MELD評分常被用來評估受者術后存活情況，故該因子被排除在外，未做進一步分析。單因素分析顯示，腫瘤最大直徑>5 cm、衛星灶、門靜脈癌栓、微血管侵犯、AFP>769 ng/mL、NLR>3.75、免疫組化染色AFP、CK19陽性以及 KLI>0.25均是影響患者術后無復發生存時間的因素(P值均<0.05)(表2)。

表1 117例患者的一般資料Table 1 The general data of 117 patients

2.3 多因素Cox回歸分析篩選模型變量 在將上述9個變量進行多變量分析之前，對預測變量進行了多重共線性評估。各組間方差膨脹因子均小于10，容忍度大于0.2，說明各因素之間不存在共線性問題[15]。隨后將上述9個指標納入多因素分析。Cox多因素回歸分析結果顯示只有KLI>0.25、術前血清AFP>769 ng/mL，NLR>3.75是影響患者術后復發的危險因素(P值均<0.05)(表2)。

2.4 建立模型 根據多因素Cox回歸分析的結果，用KLI、AFP、NLR三個因子構建肝移植術后HCC復發預測模型。根據每個因子的β系數賦予相應得分。KLI>0.23得1分，AFP>769 ng/mL和NLR>3.75分別得1.5分，其余均得0分，將所得評分相加即為總分，個人總分為4分(表3)。Hosmer-Lemeshow檢驗顯示P=0.184，說明該模型擬合優度良好。模型AUC為0.843(95%CI:0.764～0.903,P<0.001)，最佳截斷值為1.25，具有良好的靈敏度(88.7%)及特異度(70.3%)(圖2)。

比較不同得分之間的無復發生存率發現，得分0～1分的患者具有較低的復發率以及較好的無復發生存率，而1.5～4分的患者復發率較高，無復發生存率較低。因此將患者分為低危組(0～1分)和高危組(1.5～4分)，log-rank檢驗顯示高危組患者術后3年、5年無復發生存率(10.9%、10.9%)明顯低于低危組患者(84.1%、72.0%)(χ2=29.425，P<0.001)。比較這兩組患者的總體生存率，發現高危組患者術后3年、5年總生存率(36.8%、36.8%)也明顯低于低危組患者(81.9%、74.5%)(χ2=14.800，P<0.001)(圖3)。

表2 單因素及多因素Cox回歸分析結果Table 2 The results of univariate and multivariate Cox regression analysis

圖2 新HCC復發預測模型的預測能力Figure 2 The performance of the new model for predicting HCC recurrence表3 基于多因素Cox回歸分析β系數的模型得分Table 3 The score of the model based on β coefficient ofmultivariate Cox regression analysis

變量β系數得分AFP>769 ng/mL1.4881.5NLR>3.751.3551.5KLI>0.250.9771.0

3 討論

超米蘭標準HCC患者肝移植術后腫瘤復發使其預后不能令人滿意。現有研究[16]報道了多種與肝移植術后HCC復發有關的檢驗學及病理學參數。Ma等[17]發現腫瘤個數、腫瘤最大直徑以及術前AFP水平等指標與HCC復發有關，并將其納入到模型構建中，獲得了比單一因素更為有效的預測模型。Shimamura等[18]根據影像學及血清學檢查使用血清AFP、腫瘤直徑及個數等指標也構建了一個評價效果良好的模型。但這兩種模型均不是針對超米蘭標準HCC的患者。本研究根據患者術前NLR、AFP水平以及KLI，構建了一個針對超米蘭標準HCC患者的預測模型且預測效能良好。

術前高NLR反映出機體的低淋巴細胞和高中性粒細胞狀態。前者表明機體對腫瘤的免疫反應較差，后者反映了VEGF的水平，而VEGF與腫瘤血管生成及腫瘤進展密切相關[12]。術前高NLR已被證明與多種實體腫瘤的不良生存結果相關[19-21]。在Motomura等[12]的研究中，無論HCC患者是否符合米蘭標準，NLR≥4的患者活體肝移植術后5年無復發生存率均低于NLR<4的患者。術前高NLR是影響患者術后復發的重要危險因素。

注：a，術前血清AFP；b，年齡；c，腫瘤最大直徑；d，KLI；e，MELD評分；f，NLR。

AFP用于肝癌的診斷和復發監測已有數十年的歷史[22]。現有研究也表明，AFP水平是肝移植術后腫瘤復發的獨立危險因子，其預測HCC復發的能力也在多種預測模型中被強調[18,23-26]。但在不同的研究中，AFP水平預測肝癌復發的截斷值是不同的。本研究根據ROC曲線取得的最佳截斷值能很好的將不同的患者區分開。但僅考慮AFP顯然是不夠的，筆者納入了包括AFP在內的3個腫瘤相關指標，發現其預測價值要優于單一AFP。

Ki67是一種核蛋白，被認為是細胞增殖的敏感標志，反映了惡性腫瘤細胞的比例，與腫瘤的進展和轉移相關[27-28]。多項研究[29-32]發現，高KLI在前列腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌等多種癌癥中與患者的預后密切相關。在HCC中，ki67的表達被認為與肝癌細胞的增殖和惡性生物學活性有關，并且高KLI的肝癌易發生侵襲和轉移[7]。然而，關于ki67的表達與HCC患者肝移植術后腫瘤復發研究較少。Zhang等[7]雖然發現腫瘤組織ki67陽性與肝移植術后HCC復發相關，但他并沒有給出KLI，也沒有量化ki67與肝移植術后HCC復發的關系。本研究根據免疫組化評估KLI，找到了能將不同危險程度的患者區分開的最佳截斷值，并且發現KLI>0.25是肝移植術后HCC復發的重要危險因素。隨后將其納入到預測模型中，并取得了良好的預測價值。

圖3 兩組患者的無復發生存率與總體生存率比較Figure 3 The comparison of recurrence-free survival and overall survival between the two groups

本研究也存在一定的局限性。首先本研究是一項單中心、回顧性研究，且大部分患者病因都是乙型肝炎，這可能會造成一定的選擇偏倚。其次由于樣本量的限制，也使得本研究的結果需要更多的外部樣本量來驗證。

總之，超米蘭標準的肝癌肝移植要慎重進行，本研究根據患者術前NLR、AFP水平以及KLI建立了一個有效預測此類患者肝移植術后復發的模型，有助于更精準地把握此類患者的肝移植指征，并為肝移植術后的隨訪和治療提供一定的參考。

倫理學聲明：本研究于2021年8月17日經天津市第一中心醫院醫學倫理委員會批準，批號：2021N071KY。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：張煒琪負責資料收集，數據分析及文章撰寫；蔣文濤負責課題設計，研究指導，審校并最終定稿；謝炎、陳池義、賀健、譚玉瑩、黃亞北、張驪參與數據收集和分析。