基于同源雙交換的聚球藻PCC 7942基因組大片段無標(biāo)記刪除

柯竹芳 徐旭東 高 宏

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所中國科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

藍(lán)藻是一類具植物型放氧光合系統(tǒng)的原核生物, 被廣泛用于光合作用[1]、原核細(xì)胞分化和圖式形成[2]、固氮作用和晝夜節(jié)律[3]等研究。同時, 藍(lán)藻還可能作為微藻細(xì)胞工廠, 合成多種天然活性物質(zhì)和工業(yè)化學(xué)品, 極具開發(fā)利用潛力[4]。在藍(lán)藻合成生物學(xué)中, 基因組簡化有利于提高底盤基因組的可控性和可預(yù)測性, 避免無關(guān)基因的干擾, 為藍(lán)藻合成生物學(xué)的研究和應(yīng)用提供一個優(yōu)化的底盤細(xì)胞。通過自上而下的基因組簡化是構(gòu)建底盤細(xì)胞的重要途徑[5], 借助基因組編輯技術(shù)刪除冗余序列可以獲取基因組簡化藻株。若是對基因組中非必需基因逐個地刪除, 工作量大且耗時久。因此, 發(fā)展高效的大片段無標(biāo)記刪除技術(shù)是基因組簡化的關(guān)鍵。無標(biāo)記遺傳操作技術(shù)在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌基因組簡化研究中已取得較大的進(jìn)展[6—9],而藍(lán)藻基因組簡化的研究發(fā)展相對較晚, 在藍(lán)藻細(xì)胞中開發(fā)基因組大片段無標(biāo)記刪除技術(shù)進(jìn)行基因組簡化對于構(gòu)建高效的合成生物學(xué)平臺很有必要。理論上, 傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)可以用于無標(biāo)記的基因刪除, 但是應(yīng)用此技術(shù)在藍(lán)藻中進(jìn)行大片段的無標(biāo)記刪除目前尚沒有報道。為此, 本研究嘗試使用傳統(tǒng)的同源重組和篩選技術(shù)刪除藍(lán)藻中的大片段, 為進(jìn)一步開展基因組簡化研究打下基礎(chǔ)。

聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942是一種單細(xì)胞淡水藍(lán)藻, 最早被稱為Anacystis nidulansR2, 也是最早發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化的藍(lán)藻[10],實(shí)際上也可以通過接合轉(zhuǎn)移開展遺傳操作。由于生長快速、結(jié)構(gòu)簡單和具有高效的遺傳操作系統(tǒng)[11—13]等特點(diǎn), 是研究光合作用和晝夜節(jié)律的重要模式生物, 并且正被開發(fā)為用作生產(chǎn)可再生燃料、化學(xué)品和藥物的細(xì)胞工廠。2015年, Rubin等[14]完成對聚球藻PCC 7942全基因組的飽和誘變, 利用轉(zhuǎn)座插入突變和測序方法, 發(fā)現(xiàn)其基因組的2723個基因中有1748個為非必需基因。聚球藻PCC 7942基因組中的非必需基因的確定為我們進(jìn)行大片段刪除提供了重要信息。本研究以聚球藻PCC 7942基因組中3個大于10 kb的非必需區(qū)域的無標(biāo)記刪除為例, 證明利用傳統(tǒng)技術(shù)在藍(lán)藻中進(jìn)行無標(biāo)記刪除大片段的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株(藻株)、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

聚球藻PCC 7942系中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所呂雪峰實(shí)驗(yàn)室提供, 在30℃, 30 μE/(m2·s)連續(xù)光照條件下以BG11液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)。通過測定OD730來檢測藻株生長情況, 待藻細(xì)胞生長達(dá)到對數(shù)期時用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。E. coliDH5a、E.coliHB101在37℃以LB振搖培養(yǎng)。含有質(zhì)粒的大腸桿菌根據(jù)其攜帶的抗性基因補(bǔ)加相應(yīng)抗生素: 50 μg/mL壯觀霉素 (Sp)、100 μg/mL氨芐青霉素 (Ap) 或10 μg/mL四環(huán)素(Tc)、20 μg/mL氯霉素 (Cm), 使用2種及以上抗生素時濃度減半。所有BG11或LB固體培養(yǎng)基中補(bǔ)加1.5%瓊脂。接合轉(zhuǎn)移時向BG11固體培養(yǎng)基添加10 μg/mL硫酸鏈霉素 (Smr) 或25 μg/mL壯觀霉素 (Spr), 篩選雙交換轉(zhuǎn)化子時向BG11固體培養(yǎng)基中添加5%的蔗糖。質(zhì)粒pRL443[15]、pRL623[15]和pRL277[16]來自美國密西根州立大學(xué)Peter Wolk實(shí)驗(yàn)室。

1.2 DNA操作方法

藍(lán)藻基因組的提取參照Cai和Wolk[17]所描述的方法進(jìn)行, 稍加修改。50 μL PCR反應(yīng)體系中含25 μL 2×Phanta Max Buffer, 1 μL dNTP Mix (10 mmol/L),上下游引物(10 μmol/L)各2 μL(表 1), 1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U), 模板DNA適量, 其余用ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序: 首先, 95℃預(yù)變性3min; 然后, 按照95℃變性15s, 58℃退火15s, 72℃延伸1min 30s進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng); 最后, 72℃終延伸5min。融合PCR反應(yīng)參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。限制性酶切、連接和轉(zhuǎn)化等DNA重組操作按Molecular Cloning[19]描述的方法進(jìn)行。PstⅠ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用乙醇沉降并洗滌純化。之后純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)PstⅠ和SacⅠ酶切并克隆至經(jīng)相同酶切的pRL277中, 所得克隆均經(jīng)過測序驗(yàn)證確保沒有發(fā)生突變。

表1 本研究中用到的引物Tab. 1 Primers used in this study

1.3 藍(lán)藻和大腸桿菌的接合轉(zhuǎn)移

聚球藻PCC 7942接合轉(zhuǎn)移參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行,略有改動。待藻細(xì)胞生長至OD730為0.8—1.2時取10 mL藻液離心收集, 用BG11洗3次, 重懸于1 mL的BG11中。同時收集10 mLE. coliHB101 (pRL443+pRL623+運(yùn)載質(zhì)粒), 用LB洗滌3次并重懸于1 mL LB中。將藻液和菌液混合, 弱光孵育4h后涂布到覆蓋有硝酸纖維素濾膜的BG11平板上, 每個平板涂布200 μL菌藻混合液。光照24h后將膜轉(zhuǎn)到含有10 μg/mL硫酸鏈霉素的BG11平板上繼續(xù)培養(yǎng)至接合子長出。

1.4 藍(lán)藻突變株的篩選

突變株的篩選參考在魚腥藻PCC7120中描述的方法[20], 但篩選雙交換子時不使用任何抗生素標(biāo)記。先將接合子在含硫酸鏈霉素平板上劃線培養(yǎng),待長出之后轉(zhuǎn)接至20 mL含相應(yīng)抗生素的BG11中傳代培養(yǎng)并提取基因組DNA, 進(jìn)行PCR檢測篩選完全分離的單交換子。然后, 涂布到含5%蔗糖的BG11固體培養(yǎng)基進(jìn)行雙交換子的篩選。待雙交換子長出后, 劃線于含5%蔗糖的BG11固體培養(yǎng)基, 再轉(zhuǎn)接到BG11中進(jìn)行培養(yǎng)并提取其基因組進(jìn)行PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 用于大片段刪除的質(zhì)粒構(gòu)建

利用傳統(tǒng)同源重組技術(shù)刪除非必需區(qū)域大片段所用的質(zhì)粒攜帶有兩側(cè)同源臂、oriT位點(diǎn)、抗性選擇標(biāo)記和sacB致死基因, 但不能在藍(lán)藻細(xì)胞中自主復(fù)制。利用接合轉(zhuǎn)移將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到聚球藻PCC 7942中, 質(zhì)粒通過其中一個同源臂與基因組DNA發(fā)生單交換整合到基因組上; 單交換子基因組中的另一同源片段再發(fā)生同源重組, 經(jīng)過含5%蔗糖的BG11的篩選, 殺死攜帶sacB的細(xì)胞, 就可實(shí)現(xiàn)非必需區(qū)域的無標(biāo)記刪除(圖 1)。

圖1 兩步同源重組刪除大片段的示意圖Fig. 1 A schematic diagram showing the deletion of a large DNA fragment via two-step homologous recombinations將帶有兩側(cè)同源序列的質(zhì)粒通過單交換整合到聚球藻PCC7942基因組中, 獲得帶有Spr/Smr抗性的單交換子; 之后, 在蔗糖平板上篩選發(fā)生第二次交換的藻落The plasmid with two homologous DNA fragments was integrated into the genome of Synechochoccus sp. PCC 7942 via single crossover; colonies with double crossover were selected on sucrose-containing plates

為刪除聚球藻PCC 7942基因組中3個大于10 kb的非必需區(qū)域, 即Synpcc7942_0050～Synpcc7942_0064(簡稱0050-0064)、Synpcc7942_0233～Synpcc 7942_0253(簡稱0233-0253)、Synpcc7942_1391～Synpcc 7942_1400(簡稱1391-1400), 作者利用pRL277構(gòu)建了用于相應(yīng)基因組區(qū)段刪除的質(zhì)粒。以0050-0064為例, 用基因組DNA為模板、以引物0050-0064-F1/R1和0050-0064-F2/R2(表 1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得待刪除區(qū)域兩側(cè)的同源臂, 將二者通過融合PCR獲得的融合片段經(jīng)PstⅠ和SacⅠ酶切并克隆至質(zhì)粒pRL277, 得到用于0050—0064基因組區(qū)段刪除的質(zhì)粒pHB6442。用同樣的方法克隆得到用于0233—0253和1391—1400基因組區(qū)段刪除的質(zhì)粒pHB6522和pHB6615。

2.2 單交換子的獲得

接合轉(zhuǎn)移的完成需要運(yùn)載質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒和接合質(zhì)粒的參與。本實(shí)驗(yàn)中用到的接合質(zhì)粒為pRL443, 輔助質(zhì)粒為pRL623。通過轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的pHB6442、pHB6522 和pHB6615三個運(yùn)載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E. coliHB101(pRL443+pRL623), 得到用于接合轉(zhuǎn)移的3個菌株E. coliHB101(pRL443+pRL623+pHB6442)、E. coliHB101(pRL443+pRL623+pHB6522)

和E. coliHB101(pRL443+pRL623+pHB6615)。

將3個E. coliHB 101(運(yùn)載質(zhì)粒+pRL443+pRL623)菌株分別與聚球藻PCC 7942進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移, 運(yùn)載質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到藻細(xì)胞中。由于沒有藍(lán)藻復(fù)制子, 運(yùn)載質(zhì)粒不能在藍(lán)藻中自主復(fù)制, 必須通過其攜帶的同源臂與基因組非必需區(qū)域的上游或者下游同源部分發(fā)生單交換(圖 2)。通過同源臂發(fā)生整合, 運(yùn)載質(zhì)粒穩(wěn)定存在于PCC 7942的基因組上。所有藻株經(jīng)過多輪的篩選, 以基因特異的引物(表 1)進(jìn)行PCR檢測。

圖2 單交換子的PCR檢測引物位置示意圖Fig. 2 A schematic diagram showing the location of primers used for PCR detection of single crossover recombinantsF′和R′為兩側(cè)同源臂以外序列的引物, F1和R2為用于擴(kuò)增同源臂的4條引物中的2條, 1和2為待刪除非必需區(qū)域內(nèi)側(cè)的引物F′ and R′ are primers beyond the two homologous arms, F1 and R2 are 2 of 4 primers for PCR amplification of the homologous arms,1 and 2 are primers located within the large DNA fragment to be deleted

在Synechococcus7942::pHB6442接合子的PCR檢測中, 發(fā)現(xiàn)隨機(jī)篩選的接合子中有一半的概率為同時發(fā)生上游和下游的單交換整合的突變株(結(jié)果未附)。圖 3中泳道1—12為Synechococcus7942::pHB6442同時發(fā)生上游和下游單交換整合的突變株檢測。挑選Synechococcus7942::pHB6522和Synechococcus7942::pHB6615的接合子進(jìn)行PCR檢測時, 未觀察到這種情況。圖 3中泳道13—18為Synechococcus7942::pHB6522 發(fā)生下游單交換整合的突變株檢測, 泳道19—24為Synechococ-cus7942::pHB6615發(fā)生下游單交換整合的突變株檢測。

圖3 分離完全的單交換突變株的PCR檢測Fig. 3 PCR examination of completely segregated singlecrossover mutants泳道M1為1 kb DNA Ladder, 條帶大小從上而下依次是10、8、6、5、4、3、2、1.5、1.0和0.5 kb; 泳道M2為Trans 5K DNA Marker, 條帶大小從上而下依次是5、3、2、1.5、1、0.8、0.5和0.3 kb; 泳道1和2為pHB6442單交換接合子, 泳道3為野生型, 引物為0050-0064-Fˊ/2; 泳道4和5為pHB6442單交換接合子,泳道6為野生型, 引物為0050-0064-Fˊ/R2; 泳道7和8為pHB6442單交換接合子, 泳道9為野生型, 引物為0050-0064-1/Rˊ; 泳道10和11為pHB6442單交換接合子, 泳道12為野生型,引物為0050-0064-F1/Rˊ; 泳道13和14為pHB6522單交換接合子,泳道15為野生型, 引物為0233-0253-1/Rˊ; 泳道16和17為pHB6522單交換接合子, 泳道18為野生型, 引物為0233-0253-F1/Rˊ; 泳道19和20為pHB6615單交換接合子, 泳道21為野生型,引物為1391-1400-1/Rˊ; 泳道22和23為pHB6615單交換接合子,泳道24為野生型, 引物為1391-1400-F1/RˊLane M1, 1 kb DNA ladder (from top to bottom: 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2,1.5, 1.0, 0.5 kb); lane M2, Trans 5K DNA Marker (from top to bottom: 5, 3, 2, 1.5, 1, 0.8, 0.5, 0.3 kb). Lanes 1 and 2 show PCR detection of Synechococcus PCC 7942::pHB6442 singlerecombinants, lane 3 shows detection of the wild type (WT)control, where primers 0050-0064-Fˊ/2 were used. Lanes 4 and 5,Synechococcus PCC 7942::pHB6442; lane 6, WT; primers: 0050-0064-Fˊ/R2. Lanes 7 and 8, Synechococcus PCC 7942::pHB6442;lane 9, WT; primers: 0050-0064-1/Rˊ. Lanes 10 and 11,Synechococcus PCC 7942::pHB6442; lane 12, WT; primers: 0050-0064-F1/Rˊ. Lanes 13 and 14, Synechococcus PCC 7942::pHB 6522; lane 15, WT; primers: 0233-0253-1/Rˊ. Lanes 16 and 17,Synechococcus PCC 7942::pHB6522; lane 18, WT; primers: 0233-0253-F1/Rˊ. Lanes 19 and 20, Synechococcus PCC 7942::pHB 6615; lane 21, WT; primers: 1391-1400-1/Rˊ. Lanes 22 and 23,Synechococcus PCC 7942::pHB6615; lane 24, WT; primers: 1391-1400-F1/Rˊ

2.3 無標(biāo)記刪除

由于運(yùn)載質(zhì)粒上含有蔗糖致死基因sacB, 所以單交換突變株不能在含5%蔗糖的BG11培養(yǎng)基中生長。利用蔗糖篩選第二步交換時, 可能獲得定向突變株, 也可能獲得回復(fù)的野生型(決定于哪一側(cè)發(fā)生交換), 概率各占50%, 因此需要從多個蔗糖抗性的藻落中挑選出無標(biāo)記刪除突變株。挑取蔗糖平板上獲得的藻落, 擴(kuò)大培養(yǎng), 反復(fù)篩選, 并進(jìn)行兩對PCR檢測, PCR擴(kuò)增30個循環(huán)。圖 4顯示最終獲得的無標(biāo)記刪除突變株ΔSynpcc 0050-0064、ΔSynpcc 0233-0253和ΔSynpcc 1391-1400, 所刪除片段均在10 kb以上, 其細(xì)胞中完全沒有野生型基因組存在。

圖4 分離完全的雙交換突變株的PCR檢測Fig. 4 PCR examination of completely segregated double-crossover mutants泳道M為Trans 5K DNA Marker, 條帶大小從上而下依次是5、3、2、1.5、1、0.8、0.5和0.3 kb。泳道1和2為雙交換突變株, 泳道3為野生型, 引物為Fˊ/Rˊ; 泳道4和5為雙交換突變株, 泳道6為野生型, 引物為Fˊ/2Lane M, Trans 5K DNA Marker (from top to bottom: 5, 3, 2, 1.5, 1, 0.8, 0.5, 0.3 kb). Lanes 1 and 2 show PCR detection of double-crossover recombinants, lane 3 shows detection of the wild type (WT) control using primers of Fˊ/Rˊ. Lanes 4 and 5 were double-crossover recombinants; lane 6 was WT using primers of Fˊ/2

3 討論

原核生物中已有若干種報道了基因組的簡化研究。譬如, 在大腸桿菌(Escherichia coli)K-12中刪除不穩(wěn)定片段和非必需基因, 獲得了基因組減少15%的菌株[21]。該菌株生長能力和蛋白表達(dá)特性依舊良好, 并且電擊轉(zhuǎn)化效率和質(zhì)粒穩(wěn)定性等性狀有所提高。再如, 在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中刪除非必需基因, 獲得了一系列基因組刪減程度不同的菌株。這些菌株的生長速率和轉(zhuǎn)化效率變低, 但細(xì)胞產(chǎn)量提高[22]。藍(lán)藻在微生物合成生物學(xué)研究中具有獨(dú)特的價值, 基因組簡化也是在藍(lán)藻構(gòu)建良好的底盤細(xì)胞所需要的。聚球藻PCC 7942基因組較小, 而且其基因組中的非必需基因已經(jīng)系統(tǒng)地鑒定, 為此, 我們選用該藻株開展基因組的簡化工作。

借助于同源重組和條件致死基因sacB可在某些細(xì)菌獲得無標(biāo)記的刪除突變株, 應(yīng)用于基因組簡化[22]。這一過程既可以利用線性DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞來實(shí)現(xiàn), 也可以通過質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移來實(shí)現(xiàn)。聚球藻PCC 7942的遺傳操作通常是借助于DNA的轉(zhuǎn)化作用, 但實(shí)際上也完全可以利用接合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒導(dǎo)入其細(xì)胞, 而對于實(shí)現(xiàn)單交換來說, 接合轉(zhuǎn)移的效率要高得多。本研究結(jié)果顯示, 接合轉(zhuǎn)移可以有效地將質(zhì)粒導(dǎo)入該藻株, 并獲得單交換子。

在以往的報道中, 利用傳統(tǒng)的同源重組和sacB的條件致死作用可以在藍(lán)藻篩選獲得一些小片段DNA刪除的突變株[23]。而且, 由于藍(lán)藻細(xì)胞中具有多拷貝基因組[24], 使用傳統(tǒng)同源重組技術(shù)刪除基因組片段, 在第二步重組篩選時沒有抗性選擇標(biāo)記, 往往會篩選到未分離完全的突變株, 也就是仍攜帶野生型基因組的突變株。雖然如此, 我們發(fā)現(xiàn)利用這一方法可以在聚球藻PCC 7942實(shí)現(xiàn)10 kb以上區(qū)域的刪除, 并且在3個非必需區(qū)域的刪除中都獲得了成功。因此, 應(yīng)用傳統(tǒng)的方法也可以對藍(lán)藻基因組進(jìn)行大片段刪除, 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)簡化。一般來說,第一步同源重組時, 質(zhì)粒會整合到基因組的上游或者下游, 但是在我們的實(shí)驗(yàn)中也觀察到質(zhì)粒同時整合到相應(yīng)位置的上游和下游的情形。選取上下游同時發(fā)生單交換的單交換子進(jìn)行第二步重組篩選,更容易獲得完全分離的缺失突變株。譬如, 在刪除Synpcc7942_0050-0064基因組區(qū)段時, 選取上下游同時發(fā)生雙交換的藻株進(jìn)行第二步重組篩選, 所檢測的15個克隆全部為分離完全的缺失突變株。

藍(lán)藻的接合轉(zhuǎn)移和基于sacB的篩選系統(tǒng)最早是在絲狀固氮藍(lán)藻發(fā)展起來的, 實(shí)際上對于單細(xì)胞藍(lán)藻也是適用的。所以, 我們有理由相信, 本研究展示的大片段基因組刪除方法在可遺傳操作的藍(lán)藻中是廣泛適用的。盡管本研究證明傳統(tǒng)的同源重組和篩選技術(shù)可以對藍(lán)藻基因組大片段進(jìn)行無標(biāo)記刪除, 但是其兩步篩選一般耗時較長, 有時還難以獲得完全分離的突變株。已有研究報道,在集胞藻 (Synechocystissp.) PCC 6803、聚球藻(Synechococcussp.) UTEX 2973和魚腥藻 (Anabaenasp.) PCC 7120等3種藍(lán)藻中借助Cpf1可實(shí)現(xiàn)基因敲入、敲除和定點(diǎn)突變[25]。還有報道顯示,在魚腥藻PCC7120中利用CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)可刪除118 kb大片段[26]。因此, 進(jìn)一步引入Cpf1等特異的DNA剪切系統(tǒng)或可顯著加速無標(biāo)記刪除突變株的篩選過程。