miR-139555及其靶基因PtNBC在三疣梭子蟹適應鹽度脅迫中的表達調控

趙笑顏 呂建建, 張 文 吳 捷 金 玲 劉 萍,

(1. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306; 2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所,農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學與技術國家實驗室,海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 青島 266235)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus), 屬節肢動物門(Arthropoda), 甲殼綱(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae), 梭子蟹屬(Portunus), 分布于我國黃渤海、東海, 日本、朝鮮、馬來西亞群島等諸多海域, 是重要的海水經濟蟹類之一[1,2]。三疣梭子蟹作為海水“弱”高滲調節型種類[3],養殖水體鹽度驟變容易影響其體內離子及滲透平衡, 進而影響其蛻皮、攝食及生存[4—6]; 鹽度變化也會引起其機體免疫能力下降, 增加疾病發生的幾率[7]。探討三疣梭子蟹鹽度適應機制, 對其健康養殖及耐鹽良種培育有十分重要的意義。

通過鰓上皮細胞的離子跨膜轉運維持機體內的滲透壓和離子平衡是甲殼動物進行滲透壓調節的主要方式[8]。microRNA(miRNA)是一類具有重要功能的非編碼小分子RNA, 能夠在轉錄后調控靶基因的表達, 在生物發育、分化及抗逆過程中發揮巨大作用[9,10]。已有研究表明, miRNA在水生動物的滲透調節中發揮重要作用[11], 如在斑馬魚(Danio rerio)中miR-200a和miR-200b直接調控Na+/H+exchanger基因的表達, 影響離子細胞中Na+的跨膜運輸[12]; 抑制羅非魚(Oreochromis niloticus)體內miR-206的表達, 可顯著提高IGF-1mRNA水平, 從而間接調控離子轉運基因Na+/K+-ATPase和NKCC的表達[13,14]; 在刺參(Apostichopus japonicas)中, miR-10通過調控TBC1D5(胞內轉運和應激誘導的自噬之間的一個關鍵的分子開關)基因的表達來適應鹽度脅迫[15,16]。目前, 甲殼類中有關miRNA的研究較少, 且研究內容主要為性別和免疫等領域[17—20], 少有研究關注 miRNA 在甲殼動物滲透壓調節中的功能。

在前期工作中, 通過比較轉錄組和生物信息學方法篩選到了在低鹽脅迫下三疣梭子蟹鰓組織中差異表達的miR-139555, 預測其靶基因為離子轉運相關的PtNBC基因(碳酸氫鈉協同轉運基因, 英文名稱: Sodium bicarbonate cotransporter, 縮寫NBC)。本研究克隆了PtNBC基因并進行了序列特征分析,開展了該基因和miR-139555在三疣梭子蟹主要組織中的表達分布規律及在低鹽脅迫后鰓中的表達模式分析。研究結果將明確miR-139555與其潛在靶基因PtNBC的調控關系, 有助于系統解析三疣梭子蟹鹽度適應機制。

1 材料與方法

1.1 miRNA的篩選及靶基因預測

本實驗室前期對低鹽脅迫處理的三疣梭子蟹鰓組織進行高通量測序, 獲得了轉錄組及miRNA數據庫。首先, 從miRNA數據庫中篩選到了差異表達的miR-139555。使用RNAhybrid軟件進行miRNA-139555的靶基因預測。根據miRNA與靶基因的序列匹配、miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩定性, 篩選出最小自由能低于?30 kCal/mol 的候選目標, 最終獲得miR-139555的靶基因為PtNBC。miRNA-139555與PtNBC的結合位點在該基因mRNA 5′UTR的427—433 bp, 兩者結合的最小自由能(mfe)為–36.1 kCal/mol。

1.2 材料

實驗動物均取自山東省昌邑市海豐水產養殖有限公司黃海水產研究所實驗基地。隨機選取80日齡活力良好的健康三疣梭子蟹, 平均體重(25±3) g。實驗動物在室內養殖車間的水泥池暫養7d, 暫養期間, 鹽度34, 溫度(26±2)℃, 持續充氧, 每天更換 1/3 體積的海水且定時投喂新鮮餌料。隨機選取9只暫養后的三疣梭子蟹, 設置3個平行, 每個平行3只, 分別取肌肉、心臟、胃、腦、眼柄、血細胞、肝胰腺和鰓共8個組織, 液氮儲存備用。

隨機選取暫養的三疣梭子蟹進行低鹽脅迫實驗。實驗設置2組: 對照組(海水鹽度34)和低鹽11脅迫組(72h-LC50為11[21]), 每組設置3個平行, 每個平行30只。在3個水泥池中注入正常海水, 另選3個水泥池將海水鹽度調節至11(用淡水勾兌), 鹽度穩定后將各組三疣梭子蟹分別放置于池中。分別在脅迫0、12h、24h、48h和72h各時間點取鰓組織, 每個平行取3只, 于液氮中保存備用。

1.3 PtNBC基因cDNA全長克隆

用TRIzol法提取未經低鹽脅迫處理的三疣梭子蟹鰓、肝胰腺和肌肉等組織的RNA, 核酸定量儀(NanoDrop 2000 Thermo Scientific)檢測RNA的濃度及質量、1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。將各組織中的總RNA均勻混合, 使用TaKaRa公司的SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit試劑盒合成3′和5′ RACE cDNA模板。從轉錄組數據庫中篩選獲得了PtNBC序列, 用Primer Premier 5.0軟件設計特異的3′和5′RACE引物, 引物由上海生工生物公司合成(表 1)。使用南京諾唯贊生物公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase進行3′和 5′的巢式擴增, PCR產物使用膠回收試劑盒(購自TaKaRa公司)進行目的片段回收, 連接(全式金pEASY-T1 Cloning), 轉化(全式金Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell), 挑取陽性單克隆, 進行菌落 PCR 鑒定(M13引物), 將目的單克隆菌液測序(上海生工生物工程有限公司)。

表1 本研究中所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.4 序列生物信息學分析

使用Contig Express軟件將測序獲得的3′序列、5′序列與驗證的基因序列進行拼接, 得到PtNBC基因cDNA全長。利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測該基因的開放閱讀框。使用 Signal4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件預測該基因編碼蛋白的信號肽、跨膜結構和功能結構域。目的基因與其他物種的一致性及同源性分析采用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。氨基酸序列多重序列比對使用DNAMAN 5.2.9軟件。進化樹構建使用MEGA 6.0軟件(鄰接法Neighbor-joining)。

1.5 PtNBC基因和miRNA-139555的組織表達及各處理組的表達特征分析

運用TRIzol法提取三疣梭子蟹全組織及各實驗組的總RNA, 并檢測質量(核酸定量儀NanoDrop 2000 Thermo Scientific)和完整性(1.0%瓊脂糖凝膠電泳)。

利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)進行反轉錄, 合成cDNA模板, 用于PtNBC基因定量分析。利用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)進行miRNA cDNA第一鏈合成, 用于miRNA-139555定量分析。

依據克隆獲得的三疣梭子蟹PtNBC序列及miRNA-139555成熟序列, 使用Primer Premer 5.0及miRNA Design V1.01軟件設計特異性RT-PCR引物,分別以β-actin和U6作為內參(表 1), 使用ABI 7500 Real Time PCR儀和SYBR GreenProTaqHS qPCR Kit(艾科瑞公司)試劑對樣品進行定量分析。PCR反應體系為: 2× SYBR?Green ProTaqHS Premix II 5 μL, Primer F 0.4 μL, Primer R 0.4 μL, Template cDNA 1 μL, ddH2O 3 μL。用2–??Ct法分析PtNBC基因及miRNA-139555的相對表達量, 利用SPSS 19.0軟件對數據進行分析, 使用OriginPro和EXCEL對數據進行處理,P<0.05 表明具有顯著性差異。

1.6 體外雙熒光素酶實驗

PtNBC基因的5′-UTR野生型(wt)和突變型(mut)目的片段由上海生工生物公司合成。miRNA-139555與PtNBC-5′-UTR結合位點如圖 1所示。本實驗所用雙熒光素酶報告基因表達載體為psiCHECK-2。目的片段插入位點為XhoⅠ和NotⅠ,將載體酶切后膠回收備用。用T4連接酶(Fermentas公司)進行目的基因片段與載體的連接, 利用DH5a感受態細胞(上海生工)進行轉化(抗性:Amp),37℃, 過夜培養。轉化后平板挑菌, 37℃ 250轉/分鐘搖菌14h, 用菌液進行PCR鑒定, 并將陽性克隆菌液送測序進一步驗證, 最終成功構建了PtNBC-5′-UTR-wt/mut載體。

圖1 miRNA-139555與PtNBC-5′UTR靶位點結合示意圖Fig. 1 Schematic diagram of miRNA-139555 binding to PtNBC-5′UTR target site

將293T細胞接種到96孔板中, 待細胞密度達到50%—70%時進行轉染。0.16 μg的5′UTR-wt、5′UTR-mut目的質粒分別與5 pmol的miR-139555、NC mimics(miRNA對照)兩兩混合, 再各加入10 μL DMEM充分混勻后室溫放置(溶液A)。將10 μL DMEM與0.3 μL的轉染試劑(濃度為0.8 mg/mL)充分混勻(溶液B), 室溫放置5min。將溶液A與B充分混勻, 室溫放置20min。轉染前為細胞換取新鮮培養基, 之后將轉染混合物加入混勻。37℃, 5%CO2培養。轉染6h后換取新鮮培養基, 轉染48h后收集細胞檢測, 使用Promega Dual-Luciferase system試劑盒進行熒光素酶活性檢測并記錄Renilla luciferase值。

2 結果

2.1 三疣梭子蟹PtNBC基因cDNA序列特征分析

本實驗通過克隆獲得了三疣梭子蟹碳酸氫鈉協同轉運基因cDNA全長, 命名為PtNBC, Gen-Bank登錄號為MW323548。cDNA全長5308 bp, 包含570 bp的5′-UTR、3570 bp的ORF和1168 bp的3′-UTR, 編碼1189個氨基酸, 預測到該基因的分子量為133.66 kD, 理論等電點(pI)為6.07。利用Signal4.1及SMART在線軟件預測分析氨基酸的結構特征。Signal4.1未預測到信號肽, SMART預測結果顯示,PtNBC包含10個跨膜結構域(TM)和2個功能結構域(Pfam: Band_3_cyto和HCO3_cotransp)。

2.2 PtNBC基因氨基酸序列同源性分析及進化樹構建

三疣梭子蟹PtNBC氨基酸序列與其他物種的NBC(碳酸氫鈉協同轉運)基因編碼的氨基酸進行同源性比對, 結果顯示, 該氨基酸序列與麥龍螯蝦(Cherax cainii)C. cainii_NBC1的同源性最高(85.37%); 其次是天空藍魔蝦(Cherax destructor)C.destructor_NBC1(84.63%)和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)Lv_NBC(81.30%)。系統進化樹分析顯示, 三疣梭子蟹與凡納濱對蝦首先聚為一支,然后與麥龍螯蝦和天空藍魔蝦相聚, 與魚類、昆蟲類較遠(圖 2)。

圖2 NBC氨基酸序列NJ進化樹Fig. 2 NJ evolutionary tree of NBC amino acid sequence各物種名稱及GenBank登錄號(Name and GenBank accession number of each species): 三疣梭子蟹P. trituberculatus(MW323548); 凡納濱對蝦L. vannamei(AQX43455.1); 麥龍螯蝦C. caini(AJO70192.1); 天空藍魔蝦C .destructor(AJO70010.1); 小鼠M. musculus SLC4A4(AAI48293.2); 斑馬魚D. rerio SLC4A4a(NP_001030156.1); 短腳雙眼鉤蝦H. gigas NBC(LAC22142.1); 尼羅羅非魚O. niloticus SLC4A4(XP_005451600.1); 莫桑比克羅非魚O. mossambicus SLC4A4(BAJ49842.1); 虹鱒O. mykiss NBC(NP_001117797.1); 紫色球海膽S. purpuratus NBC(NP_001073019.1); 豚鼠C. porcellus SLC4A4(NP_001166501.1); 方鼻卷甲蟲A. nasatum SLC4A8(KAB7498207.1);H. sapiens SLC4A7(XP_016863016.1); 苜蓿切葉蜂M. rotundata SLC4A4(XP_012151659.1); H. sapiens SLC4A4(AAF21718.1); H.sapiens SLC4A5(AAI09222.1); H. sapiens SLC4A8(AAH25994.1)

2.3 miR-139555及PtNBC基因組織表達分布分析

利用RT-PCR分析miR-139555及PtNBC基因在三疣梭子蟹不同組織中的相對表達情況。如圖 3所示, miRNA-139555及PtNBC基因在肌肉、心臟、胃、腦、血細胞、眼柄、肝胰腺和鰓8個組織中均有表達, miRNA-139555在鰓組織中表達量最高, 之后是在肌肉、胃和肝胰腺中表達較高, 與其他組織相比表達量有顯著性差異(P<0.05)。與miRNA-139555相同,PtNBC基因也在鰓組織中有最高表達,在肌肉、胃和腦中的表達次于腦, 與其他組織相比表達量有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 低鹽脅迫下鰓組織中miR-139555及PtNBC基因的表達

如圖 4所示, 在低鹽脅迫72h內, 與對照組相比, miR-139555整體呈現上調表達的趨勢, 在脅迫48h達到最高峰, 為對照組的4.9倍(P<0.05); miR-139555在脅迫24h及48h有下調表達的趨勢, 但與對照組相比, 均為顯著上調表達(P<0.05)。而PtNBC基因在脅迫72h內顯著下調表達, 且各時間點表達量均低于對照組, 在12h表達量最低, 為對照組的0.06倍(P<0.05); 在脅迫12—72h,PtNBC基因呈現上調表達趨勢, 但與對照組相比均顯著下調表達。綜上, 在低鹽脅迫下miR-139555與PtNBC基因在三疣梭子蟹鰓組織中的表達趨勢呈現明顯的負相關。

2.5 miR-139555作用于PtNBC基因的mRNA的體外驗證結果

利用雙熒光素酶實驗進一步驗證miRNA-139555與PtNBC基因是否具有直接的作用關系。如圖 5所示, 與其他對照組相比, 僅在miRNA-139555與PtNBC-5′-UTR-wt共同轉染入細胞的情況下, 熒光素酶的表達量顯著下降(P＜0.001), 表明PtNBC基因的表達被抑制。目的基因的突變型載體作為對照組, 排除了miRNA-139555與載體其他位點結合而影響實驗結果的可能。

3 討論

3.1 低鹽脅迫下miR-139555的表達分析

microRNA(miRNA)是一類具有重要功能的非編碼小分子RNA, 能夠在轉錄后調控靶基因的表達, 在生物抗逆過程中發揮重要作用[22—24]。為了探索miRNA在三疣梭子蟹鹽度適應中的作用, 基于前期對三疣梭子蟹低鹽脅迫前后鰓組織樣品的高通量miRNA測序分析, 我們篩選到一個在低鹽脅迫下顯著差異表達的、新預測的miRNA, 命名為miRNA-139555。本研究分析了miRNA-139555的組織表達分布及低鹽脅迫下在鰓組織中的表達規律。我們發現miRNA-139555在鰓組織中的表達明顯高于其他組織, 且低鹽脅迫后鰓組織中的miR-139555呈現顯著上調表達的趨勢, 在48h表達量最高, 相較于對照組上調4.9倍(圖 4)。鰓被認為是甲殼類離子交換和滲透調節的主要器官[25]。miR-139555在鰓中高表達且受低鹽脅迫誘導, 表明其可能在三疣梭子蟹滲透壓調節中發揮重要作用。

圖4 低鹽脅迫下miR-139555及PtNBC在三疣梭子蟹鰓組織中的表達Fig. 4 Expression of miR-139555 and PtNBC in the gills of P. trituberculatus under low salt stress

3.2 miR-139555可調控靶基因PtNBC的表達

已有研究表明, 鹽度變化可誘導水生動物體內某些miRNA差異表達, 而這些miRNA的靶基因為滲透調節相關基因[26,27]。本研究預測到miR-139555的潛在靶基因為離子轉運相關的PtNBC基因。該基因cDNA全長5308 bp, 編碼1189個氨基酸。Signal4.1未預測到信號肽, 表明PtNBC不是分泌蛋白。SMART預測結果顯示,PtNBC基因含有10個TM結構域, 和以往報道的SLC4家族成員普遍含有10－14個TM結構域一致[28]。并且與多數NBC1基因相同, 包含2個功能結構域(Pfam: Band_3_cyto和HCO3_cotransp)。進化樹分析顯示,C. destructor_NBC1與PtNBC進化關系最接近,該基因含有12個TM區域, 其中10個TM區域與PtNBC完全相同[29]。

王萍等[30]對青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)的研究表明, slc4a4(NBC)基因在主要組織中泛表達。在本研究中,PtNBC基因也顯示泛組織表達的模式(圖 3)。然而, 值得注意的是, 與miR-139555相同,PtNBC基因也在鰓組織中具有最高的表達。并且在PtNBC基因相對高表達的組織中(如肌肉、胃等), miR-139555也有較高表達, 顯示了該基因和miR-139555具有組織共定位的趨勢, 該現象與我們預測的miR-139555的靶基因為PtNBC基因相符。靶基因預測結果顯示, miR-139555作用于PtNBC基因mRNA的5′UTR區。以往的多數研究關注miRNA與靶基因3′UTR結合發揮調控功能, 但隨著對miRNA調控機制研究的不斷深入, 也有不少關于miRNA靶定基因5′UTR[31]和ORF[32]區域參與調控基因表達的報道。例如: Wigar等[33—35]研究發現,let-7能夠靶定lin-41 mRNA 5′UTR區, 影響斑馬魚的胚胎發育[36]。另外, 多個研究證實miRNA可通過靶定相關基因的5′UTR或ORF, 抑制或增強腫瘤細胞的生長。基于以上相關報道, 為進一步證明miR-139555與其潛在靶基因PtNBC間的調控關系, 我們在細胞水平開展了體外雙熒光素酶實驗。研究結果表明, 在體外細胞水平, miR-139555能夠直接抑制PtNBC基因的表達, 與低鹽脅迫下兩者呈現負相關的趨勢一致(圖 5)。

圖3 miR-139555及PtNBC在三疣梭子蟹不同組織中的表達Fig. 3 Expression of miR-139555 and PtNBC in different tissues of P. trituberculatusM. 肌肉muscle; H. 心臟heart; S. 胃stomach; Br. 腦brain; E. 眼柄optic stalk; B. 血細胞blood cell; He. 肝胰腺hepatopancreas; G. 鰓gill; 不同小寫字母代表表達量的差異顯著性Different lowercase letters indicated significant differences (P<0.05); 下同The same spplues below

圖5 雙熒光素酶報告檢測miR-139555與PtNBC-5′UTR的相互作用Fig. 5 Dual luciferase report to detect the interaction between miR-139555 and PtNBC-5′UTR

3.3 miR-139555及其靶基因PtNBC在滲透壓調節中的作用

多數研究表明, miRNA通過與靶基因的完全或不完全互補性結合降解或沉默靶基因, 從而調節基因的表達, 兩者為負調控關系[37]。比如尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)通過下調鰓組織中miR-429的表達使滲透脅迫轉錄因子(OSTF1)相應的上調表達, 來適應高鹽脅迫[38]; 在低鹽脅迫下, 刺參(Apostichopus japonicas)Aja-miR-22上調表達, 其靶基因(棘皮動物微管相關蛋白EMAP)下調表達。本實驗中我們也發現了相似的結果, 在低鹽脅迫12h,三疣梭子蟹鰓組織中miR-139555上調表達, 之后與對照組相比, 處于持續上調表達的狀態; 而PtNBC在低鹽脅迫12h下調表達, 之后持續處于下調表達的狀態, 兩者表達趨勢呈現典型的負相關(圖 4)。該結果同樣也支持miR-139555的靶基因為PtNBC基因。

Deigweiher等[39]的研究表明, 在海水硬骨魚類中,NBC1基因定位在鰓上皮細胞基底質膜上, 主要作用是協調向體內轉入Na+和HCO3–, 與水生生物的滲透壓調節或鹽度適應密切相關。Ali等[29]對C.cainii和C. destructor兩種淡水龍蝦的研究表明,NBC基因在兩個物種中均有5個亞型且均具有參與調節鹽度的功能。目前, 除PtNBC基因外, 在三疣梭子蟹轉錄組中我們并沒有發現其他與鹽度適應相關NBC基因亞型。梁從飛等[40]在尼羅羅非魚的研究中發現, NBC基因在高鹽脅迫下呈現上調表達的趨勢, 而我們的結果顯示PtNBC基因在低鹽脅迫后顯著下調表達, 兩個研究的結果相對應。我們推測, 低鹽水體中Na+的濃度較低, 為了維持體內滲透壓平衡, 三疣梭子蟹通過microRNA途徑主動降低PtNBC基因的表達而以減少Na+的吸收, 從而維持體內外的滲透壓平衡。

總而言之, 我們初步證實了PtNBC基因是miR-139555的靶基因, miR-139555可能通過調控鰓上皮細胞PtNBC基因的表達而發揮重要的滲透壓調節功能。本研究嘗試從轉錄后水平探究三疣梭子蟹的滲透調節機制, 有助于系統解析該物種鹽度適應機制, 同時為三疣梭子蟹耐鹽良種的鑒定和培育提供新的思路。