鱖plin2生物信息學分析、組織表達及其在肝臟脂肪蓄積中的作用

高俊杰 梁旭方 蔡文靜 莊武元

(1. 華中農業大學水產學院, 華中農業大學鱖魚研究中心, 武漢 430070; 2. 農業農村部淡水生物繁育重點實驗室/農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室, 武漢 430070)

細胞內脂滴(Lipid droplet, LD)在維持細胞能量穩態、新陳代謝和信號傳導中起著不同的作用[1,2]。最近研究揭示了脂滴包被蛋白(Perilipin, PLIN)在LD的發生和調節LD上的蛋白質運輸中的重要性[3,4]。PLINs是最豐富的脂滴包被蛋白, 在中性脂質代謝中起著核心作用[5]。哺乳動物的PLIN蛋白質N端具有一個保守的PAT結構域, 最近一些研究表明, PLIN家族蛋白參與了中性脂質儲存和利用的調控[6,7]。在哺乳動物中, 具有組織特異性的脂滴包被蛋白已經進化并賦予其不同的功能[8,9]。然而, 大多數關于PLIN蛋白功能的研究都是在哺乳動物系統中進行的, 主要集中在中性脂質代謝上, 而對非哺乳動物脊椎動物的研究相對較少。

在PLIN家族的5個成員中,plin2是一個在大多數組織中普遍表達的50 kD的蛋白質, 在脂滴的形成和穩定, 長鏈脂肪酸的吸收和脂質積累中起著關鍵作用[10—12]。Plin2水平受細胞內脂滴和三酰甘油含量的正調節[12]。隨著脂肪組織中的脂肪細胞成熟,plin2逐漸被plin1取代, 但在其他組織中plin2仍然作為主要脂滴相關蛋白發揮作用[7]。此外, 一些證據表明plin2在脂肪肝的誘發中起著重要作用[13,14]。研究發現plin2基因缺失可防止肥胖和胰島素抵抗,并顯著降低肝臟甘油三酯和膽固醇水平[15]。因此,plin2蛋白被認為是治療哺乳動物脂肪肝形成的潛在靶點。

脂肪肝是目前養殖魚類普遍存在的一種生理病理現象。鱖(Siniperca chuatsi)是主要原產湖北的我國傳統名貴肉食性魚, 肉質豐腴細嫩, 營養價值高, 是我國淡水養殖的理想選擇[16]。但是鱖等肉食性魚類對糖類利用能力較差, 飼料中碳水化合物過多會使其營養成分不平衡和能量攝入過多, 最終導致脂肪肝形成及生長速度下降[17]。對于魚類plin2的功能及plin2是否可以作為水產養殖中預防脂肪肝的潛在靶點, 目前還沒有系統的研究。本研究對鱖plin2基因進行了相關生物學分析和表達特征進行了研究。此外, 我們還探究了在鱖肝臟脂肪蓄積狀態下plin2基因表達情況。本研究將有助于進一步了解plin2在魚類肝臟中發揮的作用, 并為解決水產養殖業中的脂肪肝問題提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及飼養條件

實驗用魚來自湖北武漢華中農業大學鱖研究中心。120尾鱖(80±5) g隨機分為2組, 每組設置3個平行, 每缸(350 L)20尾并暫養于華中農業大學循環水系統2周, 水溫維持在(23.0±0.5)℃, pH 7.1—7.5,溶氧為7.5—7.8 mg/L, 光照周期為自然光照周期。所有的魚在馴化后投喂人工飼料。分別投喂含不同碳水化合物飼料, 對照組和實驗組分別含0淀粉和20%淀粉, 飼料配方在本實驗室先前研究中已描述[18], 所有飼料成分均購自武漢高龍飼料有限公司。在為期8周養殖期間每天早上9:00和下午17:30喂食2次。飼養試驗結束饑餓6h后每缸隨機捕獲6尾魚, 用MS222(50 mg/L)進行麻醉。獲取肝臟組織并在液氮中冷凍后保存于–80℃進行后續實驗。

1.2 不同亞型plin2基因序列分析

根據已公開的鱖基因組數據庫(http://genomes.igb-berlin.de/cgi-bin/hgGateway?db=sinChu7)獲得plin2a和plin2b序列, 通過Editseq[19]和Clustal W2[20]軟件將鱖CDS(Coding sequence)序列轉為氨基酸序列并將鱖和刺魚(Gasterosteus aculeatus)其他物種的plin2基因進行氨基酸多重序列比對(表 1)。通過對哺乳動物plin2氨基酸序列比對鱖PAT結構域和11-mer重復結構域進行鑒定, 通過Expert Protein Analysis System (https://web.expasy.org/protscale/) 預測鱖plin2的親水性。通過GenBank和ENSEMBL數據庫調取了人、斑馬魚和刺魚等3個物種的plin2氨基酸序列, 進行鱖plin2基因共線性分析。

表1 不同物種plin2氨基酸序列信息Tab. 1 Amino acid sequence information of plin2 in different species

1.3 PLIN家族進化樹分析

系統進化樹重建使用了人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、斑馬魚(Danio rerio)、刺魚(Gasterosteus aculeatus)、羅非魚(Oreochromis niloticus)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、斑點雀鱔(Lepisosteus oculatus)、腔棘魚(Latimeria chalumnae)、日本青鳉(Oryzias latipes)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、攀鱸(Anabas testudineus)、亞馬遜帆魚(Poecilia formosa)和綠河豚(Tetraodon nigroviridis)等其他物種的PLIN家族氨基酸序列,且均從GenBank和ENSEMBL數據庫中獲得。用ClustalW2對鱖與上述物種的PLIN家族進行氨基酸序列多重比對后, 通過GBLOCKs選取合適的保守區序列用于后續分析。利用ModelFinder尋找最佳的核苷酸替代模型: JTT+G4(BIC), 再通過Phylo-Suite[21]軟件使用貝葉斯法重建系統進化樹。貝葉斯法分析同時運行2個獨立的反應, 每個反應4條馬爾科夫鏈, 共運行100萬代。

1.4 鱖plin2基因組織表達檢測

從暫養于華中農業大學鱖魚研究中心循環水系統中隨機抽取6尾鱖, 用MS222(50 mg/L)進行麻醉后采集鱖脾臟、腦、肝臟、脂肪、肌肉、腸道、胃、腎臟和心臟等組織樣本, 使用RNAiso Plus(TaKaRa)抽提鱖不同組織和肝臟細胞總RNA,通過多功能酶標儀(Bio-Tek)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的純度和濃度。采用HiScript?ⅡReverse Transcriptase(Vazyme)反轉錄合成cDNA,用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme)進行RT-qPCR, 所用引物見表 2。RT-qPCR反應體系: ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)10 μL,上游引物和下游引物各0.4 μL, 模板cDNA 1 μL, 用ddH2O將反應體系補足到20 μL。反應程序為95℃,預變性5min, 然后40個循環: 95℃變性15s, 57℃退火30s, 72℃延伸45s, 溶解曲線以0.5℃/s速率從95℃降到65℃, 每隔6s采集1次數據信號。

表2 鱖組織表達引物列表Tab. 2 Primers used for the study

1.5 鱖肝臟細胞分離與培養

用麻醉劑MS222(50 mg/L)將鱖麻醉, 剪斷尾鰭放血完全后, 用75%的酒精擦拭魚體。以下操作均在無菌條件下進行, 從腹腔內小心取出肝臟, 并轉移至含有DPBS的細胞培養皿中, 清洗血塊后用解剖刀將肝組織剪成1—2 mm3左右的組織塊, 放入AIM試劑中浸泡1h, 且隔30min換一次試劑。吸走AIM并將肝組織剪碎后轉入15 mL無菌離心管中,用0.25%胰蛋白酶28℃恒溫消化30min, 每5—7min用含10% FBS的M199培養基中和消化收集細胞1次。細胞懸液經100 mm細胞篩網過濾, 以去除組織碎片, 1000 r/min, 5min收集細胞于15 mL無菌離心管, 并用紅細胞裂解液和DPBS清洗2遍以去除血液紅細胞。隨后1000 r/min, 5min用M199基礎培養基漂洗1次, 最后將收集的鱖肝細胞重懸于M199完全培養基中。將細胞接種于細胞培養板, 接種密度約為2×106個細胞/mL, 根據本實驗室先前研究結果, 選用0.1 mmol/L濃度的棕櫚酸鈉處理肝細胞構建高脂模型[22], 并將處理好的細胞放于28℃含5%CO2細胞培養箱中進行培養48h, 在倒置相差顯微鏡下觀察鱖肝臟原代細胞的生長情況。之后提取鱖肝細胞總RNA, 進行RT-qPCR相關檢測。

1.6 統計分析

用SPSS Statistics 19.0軟件對數據進行分析。以鱖核糖體蛋白L13a (Ribosomal protein L13a,rpl13a)作為內參基因, 采用2–??Ct方法計算相對基因表達水平[23]。單樣本t檢驗(One samplet-test)用來檢測數據分布的正態性; 獨立樣本t檢驗(Independent samplet-test)用來分析2個樣本之間的差異; 單因素方差分析(One-way ANOVA)用來檢驗多個樣本之間的差異性; 數據均以平均值±標準誤(mean±SE)表示, 差異顯著度為顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

2 結果

2.1 鱖plin2基因序列分析

將鱖plin2a和plin2b目的序列進行生物學信息比對分析, 其中plin2a基因包含一個1344 bp的ORF(Open Reading Frame), 編碼447個氨基酸;plin2b基因包括一個1011 bp的ORF, 編碼336個氨基酸。鱖plin2基因序列與其他物種進行氨基酸多重比對顯示, 鱖plin2a與刺魚plin2a具有高度一致性(75%), 與哺乳動物和斑馬魚中報道的plin2相比, 序列同源性為57%—59%。鱖plin2b與刺魚plin2b同源性下降到55%左右, 而與斑馬魚和哺乳動物plin2報道的氨基酸序列相比同源性處于相對較低水平(34%—40%)。通過分析發現鱖plin2具有與其他同源基因一樣的結構域, 表現出一個N-末端PAT結構域和一個11-mer重復結構域。根據哺乳動物plin2的疏水特性, 鱖plin2a和plin2b均沒有預測到有助于膜定位的疏水序列的大區域, 這表明鱖plin2內的區域可能在空間上聚集在一起形成疏水分子的識別表面。

2.2 plin2基因共線性分析

對Plin2基因進行共線性分析表明, 鱖plin2a和plin2b分別位于6號和9號染色體, 人類plin2基因位于9號染色體(圖 1)。人與鱖plin2a具有共線性的基因共有12個, 但臨近基因dennd4c、haus6和zdhhc21排列順序不同; 人與鱖plin2b具有共線性的基因共有14個, 但臨近基因acer2、smu1b、dnajal和aptx排列順序不同(圖 1)。Plin2在斑馬魚中位于15號染色體, 而刺魚與鱖表現一致, 分化為plin2a和plin2b兩個亞型, 分別位于7號和9號染色體(圖 2)。斑馬魚與鱖plin2兩個亞型都表現為沒有臨近基因,然而刺魚plin2兩個亞型與鱖的上下游基因則表現出高度的一致性(圖 2)。

圖1 鱖和人plin2基因共線性Fig. 1 Syntenic analysis for plin2 genes in S. chuatsi and H. sapiens

圖2 鱖和其他硬骨魚類plin2基因共線性Fig. 2 Syntenic analysis for plin2 genes in S. chuatsi and other teleost species

2.3 plin2進化分析

使用貝葉斯法重建鱖與其他物種PLIN家族的系統進化樹(圖 3), 聚類關系主要分為硬骨魚plin2,哺乳類plin2、plin1、plin3和plin6五個部分, 哺乳動物plin3-plin5分布于其中(圖 3a)。系統發育結果顯示PLIN家族可以分為兩大支, 其中分支Ⅰ包括plin1-plin5, 分支Ⅱ只包括plin6(圖 3b)。分支Ⅰ又可以分為plin5、plin1/plin3/plin4及plin2三個分支。其中鱖plin2a與刺魚、紅鰭東方鲀和綠河豚在進化距離上較為接近, 鱖plin2b則與攀鱸最為接近。

圖3 根據PLIN家族氨基酸序列構建的系統進化樹Fig. 3 The phylogenetic tree derived from the amino acid sequences of PLIN genesa. PLIN家族聚類關系; b. 鱖和其他物種plin2系統發育分析a. Clustering analysis based on PLIN family; b. Phylognentic tree of S. chuatsi and other species plin2

2.4 鱖plin2基因表達分布

分別對鱖的脾、腦、脂肪、肌、腸、胃、腎和心等9個組織進行plin2a和plin2b基因相對表達分析(圖 4)。Plin2a基因在鱖的肝臟中表達最高, 其次是脂肪和脾臟組織, 在其他組織中相對表達較低(圖 4A)。相反plin2b基因在鱖的肝臟中幾乎不表達, 在腎臟組織中表達最高, 其次是胃、脂肪和腦組織, 在其他組織中相對表達較低(圖 4B)。

圖4 鱖plin2a和plin2b在不同組織中的相對表達量Fig. 4 The relative expression of plin2a (A) and plin2b (B) genes in different tissues of S. chuatsi標準差上方不同字母表示差異顯著(P<0.05); 下同Different letters above the error bars indicate significant differences(P<0.05). The same applies below

2.5 高碳水化合物對plin2基因表達影響

我們先前的研究表明, 隨著飼料碳水化合物含量增加到20%, 魚體脂質含量逐漸升高, 同時組織學分析顯示, 碳水化合物含量添加20%組肝臟組織中出現大量脂滴, 進而誘發了肝臟脂肪變性。如圖 5所示, 與對照組相比, 高糖組肝臟中的plin2a基因轉錄水平極顯著上調(P<0.01)。

圖5 高糖飼料對鱖肝臟 plin2a mRNA 水平的影響Fig. 5 Effects of high-carbohydrate diet on plin2a mRNA of S.chuatsi liver標準差上方**表示差異極顯著(P<0.01)**. extremely significant differences (P<0.01)

2.6 棕櫚酸鈉刺激鱖肝臟細胞對plin2表達影響

用0.1 mmol/L棕櫚酸鈉構建的鱖肝臟原代細胞其細胞生長狀態和形態與正常培養的鱖肝臟原代細胞相比, 沒有受到顯著影響(圖 6)。

圖6 倒置相差顯微鏡下觀察的鱖肝臟原代細胞形態Fig. 6 Observation of S. chuatsi hepatocytes under inverted phase contrast microscopea. 鱖肝臟原代細胞正常培養24h (40×); b. 鱖肝臟原代細胞正常培養48h (100×); c. 鱖肝臟原代細胞經0.1 mmol/L PA刺激培養48h(100×)a. Morphology of hepatocytes cultured for 24h (40×); b. Morphology of hepatocytes cultured for 48h (100×); c. Morphology of hepatocytes cultured with 0.1 mmol/L PA for 48h (100×)

與正常鱖肝細胞相比, 用0.1 mmol/L棕櫚酸鈉構建的鱖肝臟原代細胞高脂模型中plin2a表達水平顯著增加(P<0.05; 圖 7)。

圖7 棕櫚酸鈉刺激鱖肝細胞 plin2a mRNA 水平的影響Fig. 7 Effects of palmitate on plin2a mRNA of S. chuatsi hepatocytes

3 討論

3.1 鱖plin2的分子特征

脂滴包被蛋白PLIN家族是主要的脂滴蛋白, 在脂滴形成和甘油三酯代謝中起重要作用。與哺乳動物PLIN基因家族相比, 硬骨魚類PLIN家族的組成更具物種特異性和復雜性[24]。然而, 對于PLIN家族研究主要集中在哺乳動物中, 而在硬骨魚中對PLIN家族的研究較少[25]。在PLIN家族中,plin2一般位于中性脂滴的多種組織和培養細胞系中, 被認為在哺乳動物脂肪肝的形成中起到至關重要的作用[26]。本研究對鱖plin2基因的序列和組織表達情況進行了鑒定和分析。此外, 本研究探究了在鱖肝臟脂肪處于蓄積狀態下plin2的表達變化情況。

先前研究表明, 斑馬魚和穴居魚保持著plin2的一個拷貝, 與人類的plin2同源[27]。而在硬骨魚基因組復制過程中產生的plin2基因, 如刺魚和亞馬遜帆魚保留了兩個亞型, 分別命名為plin2a和plin2b[24]。在鱖基因組中, 經過分析比對發現與刺魚和亞馬遜帆魚相同, 產生了plin2a和plin2b兩個亞型, 而plin2的加倍現象, 可能會導致其在鱖糖脂代謝中的作用更加復雜。同源性分析還表明, 鱖plin2a基因與刺魚plin2a基因具有高度的同源性, 但鱖plin2b與刺魚plin2b基因同源性并不是很高。在鱖plin2a和plin2b中發現了包括PAT結構域和11-mer重復結構域在內的人類PLIN蛋白的定義特性。高度保守的N-末端PAT結構域被認為參與了plin2的脂滴穩定和蛋白酶體降解; 11-mer重復結構域可能與C-末端結構域協同調節乳脂分泌有關[5,27]。這些結構域的保守性表明, 鱖plin2可能是針對脂滴, 其功能可能與甘油三酯的儲存和動員有關。蛋白質的親疏水性對于其折疊具有重要作用, 在我們對鱖plin2蛋白親疏水性預測后, 發現鱖plin2兩個亞型都不具有大面積疏水或親水域。有研究發現在對小鼠plin2以及plin3蛋白序列進行疏水預測中, 其N端PAT結構域和11-mer重復區域中觀察到疏水性/親水性片段的交替模式[7,12]。同時2種蛋白質未預測到大段的疏水序列, 這表明在空間上, 其蛋白質中的區域可能匯聚在一起從而形成了較大的疏水性配體識別表面發揮功能。

3.2 鱖plin2的系統發育分析

聚類分析將PLIN家族大致分為5類,plin2明顯地分為硬骨魚和哺乳動物兩部分, 其余PLIN家族分類并不十分明顯, 這可能是由于物種選擇數目不多的問題。系統發育分析主要將PLIN家族分為兩大支, 其中分支Ⅰ包括plin1-plin5, 分支Ⅱ只包括plin6。分支Ⅰ進化分析顯示鱖plin2a與刺魚、紅鰭東方鲀和綠河豚在進化距離上較為接近, 鱖plin2b則與攀鱸最為接近。脊椎動物PLIN基因家族是在脊椎動物輻射的基礎上進行了兩輪全基因組復制而產生的, 共有4個基因:plin1、plin2、plin4-plin5-plin3集群祖先和plin6[24,29]。其中plin6作為PLIN家族的額外分支, 是硬骨魚特有的[24]。經過一系列串聯復制和分化后產生了現在PLIN家族中的plin3、plin4和plin5基因, 完成了人類PLIN家族的5個基因庫。在硬骨魚基因組復制后, 4個PLIN家族基因變成了8個基因, 除plin2外其余的基因都恢復為單一拷貝, 本研究對鱖PLIN系統發育重建中也支持上述發現。

3.3 鱖plin2的組織表達分布

一般認為plin2存在于中性脂滴的多種組織和培養細胞系中, 包括乳腺、肝臟、骨骼肌、小鼠脂肪細胞和人肝癌細胞等[2,30]。本研究結果表明鱖plin2的2個亞型的組織表達情況有很大差異,plin2a基因在鱖的肝臟中表達最高, 其次是脂肪和脾臟組織。然而plin2b基因在鱖的肝臟中幾乎不表達, 與其他組織相比, 在腎、胃、脂肪和腦組織中的表達水平更高。基于plin2組織表達結果, 我們推測plin2a和plin2b在鱖脂滴形成和脂肪蓄積中的功能發生了分化,plin2a可能在鱖肝臟脂肪合成和分解中發揮更加重要的功能, 而plin2b可能主要在腎、胃、脂肪等其他組織發揮作用。

3.4 鱖plin2與肝臟脂肪蓄積密切相關

鱖等肉食性魚類對于糖類物質利用能力差, 本實驗室先前研究表明當飼料中過量添加淀粉(20%)會造成鱖肝臟脂肪蓄積[18]。為了進一步探究plin2a對鱖肝臟脂肪蓄積的影響, 首先我們通過過量投喂碳水化合物誘導了鱖肝臟中的脂質含量增加。另外, 哺乳動物體內plin2的豐度與細胞內脂質水平直接相關, 而plin2水平的升高則與脂肪堆積引起的疾病有關[28]。研究表明, 與正常人的肝細胞相比, 脂肪性肝病患者肝細胞中plin2的表達水平上調[11,14]。在喂食高脂肪或酒精飲食的小鼠中, 在酒精性肝病的實驗模型中,plin2表達上升并且包裹大量的脂滴[31]。因此, 我們同時構建了鱖肝細胞高脂模型研究plin2a的作用。本研究參考了Yang等[32]利用棕櫚酸鈉誘導了草魚肝細胞脂肪蓄積以及實驗室先前工作[22],采用棕櫚酸鈉添加劑來誘導鱖肝細胞的脂肪蓄積,先前本實驗室研究表明用0.1 mmol/L PA對鱖肝臟原代細胞進行刺激后, 其甘油三酯水平顯著增加且脂滴熒光強度增加, 因此我們選擇該濃度進一步研究plin2功能作用[22]。我們的結果表明, 與不添加淀粉組相比, 鱖肝臟plin2a的mRNA表達水平極顯著增加。在細胞水平上同樣發現通過棕櫚酸鈉構建的鱖肝細胞高脂模型中, 細胞內plin2a的表達水平顯著增加。有研究表明,plin2作為肝臟組織中最豐富的脂滴蛋白, 與脂肪酸攝取以及脂解關系密切[11]。當肝臟敲除plin2的小鼠飼喂高脂飼料后, 其肝臟脂肪水平降低, 同時脂肪合成相關基因的表達受到抑制[14,15]。在哺乳動物中plin2過量表達會造成肝細胞中甘油三酯沉積, 從而導致脂肪變性。而抑制plin2表達可能在防止肝臟脂肪蓄積具有一定作用[31]。基于上述發現, 我們推測plin2a可能影響肝臟中脂肪合成和脂滴增加, 是鱖肝臟脂肪蓄積的重要調節因子。

綜上所述, 我們在本研究中鑒定出鱖plin2的2個亞型, 生物信息學分析和組織表達分布情況表明不同亞型之間可能出現功能分化, 當鱖肝臟處于脂肪蓄積狀態下plin2a表達上升, 說明該亞型可能在肝臟脂質代謝中行使一定的功能。因此, 需要進一步研究plin2對鱖肝臟脂質代謝的作用機制, 為闡明和預防鱖脂肪肝形成提供一定的理論依據。