法夫酵母高產蝦青素發酵工藝的建立

梁玲玲，徐作武，盧越巧，楊一恭，劉燕，邵東，陳克杰 (浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 紹興 312500)

0 引言

蝦青素 (Astaxanthin)被譽為“超級維生素E”，在延緩衰老，提高免疫，防治腫瘤、心血管疾病和糖尿病等方面有顯著作用[1]。蝦青素微生物生產系統已成為現今主要的商業生產方式，相比不同蝦青素生產菌株，法夫酵母具有以下優勢：(1) 無需光照，不受地理限制，易于產業化；(2) 可利用多種糖進行快速異養代謝、培養時間短[2]；(3) 菌體濃度高，進一步提升潛能大；(4)非轉基因，且已獲中國農業部和美國食品藥品監督管理局 (FDA) 批準用作動物飼料添加劑，安全可靠[3-4]。本研究圍繞菌濃和產量這兩個基本出發點，以本司保藏的高產菌株法夫酵母XC3015為研究對象，采用正交試驗設計方法對發酵配方進行優化，在補料搖瓶上考察碳源補加工藝，并在70 L發酵罐上進行新工藝驗證，初步建立了適合該菌株的蝦青素高產工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

法夫酵母 (Phaffia rhodozyma) XC3015

1.2 實驗方法

(1) 培養基的配制

固體培養基：YM培養基，成份參考文獻[5]，加入20 g/L瓊脂，調pH值為6.0，121 ℃滅菌30 min。種子培養基：YM培養基，調pH值為6.0，121 ℃滅菌30 min。

初始發酵基礎培養基：葡萄糖 7.5 g/L、麥芽糊精 7.5 g/L、糖 蜜 5.0 g/L、(NH4)2SO43.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl2·2H2O 0.1 g/L、酵母抽提物 1.0 g/L、乳酸 5.0 g/L、維生素溶液1 mL/L、金屬溶液 1 mL/L、泡敵 0.1 g/L，調pH值為6.0，121 ℃滅菌30 min。

維生素溶液：泛酸鈣 5.2 g/L、生物素 0.13 g/L、 肌醇 66.67 g/L、尼克酸 5.2 g/L、對氨基苯甲酸 0.53 g/L、VB62.67 g/L、VB12.67 g/L、核黃素 5.2 g/L。金 屬 溶 液：H3BO32.67 g/L、CuSO4·5H2O 1.6 g/L、KI 0.27 g/L、MnCl2·4H2O 2.70 g/L、Na2MoO4·2H2O 1.07 g/L、ZnSO4·7H2O 24 g/L、CoCl2·6H2O 0.8 g/L、檸檬酸鐵 24 g/L。發酵補糖培養基：葡萄糖 175 g/L、麥芽糊精 175 g/L、糖蜜 50 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌30 min。

(2) 培養方法

固體培養：取-80 ℃冰箱保藏的冷凍甘油保藏液，融化后稀釋適當倍數取0.1 mL涂布平板，平板置于20.5 ℃下恒溫培養5~7天。種子瓶培養：用接種環挑取生長良好的單菌落，接種種子培養基 (10 mL/50 mL試管)，于20.5 ℃、200 r/min條件下振蕩培養48 h，獲得成熟一級種子培養液。取2.5 mL一級種子培養液二次接種子培養基 (22.5 mL/250 mL 三角瓶)，于20.5 ℃、200 r/min條件下振蕩培養36 h，獲得成熟種子瓶培養液。發酵瓶培養：取成熟種子瓶培養液按10%接種比例接發酵培養基(45 mL /650 mL三角瓶)，于20.5 ℃、200 r/min條件下振蕩培養120 h，放瓶。補料搖瓶培養：取成熟種子瓶培養液按10%接種比例接發酵培養基 (250 mL/1 000 mL補料搖瓶)，發酵過程中根據程序設計自動補加碳源，控制pH值為5.00±0.02，在通氣比1 vvm、溫度20±0.5 ℃、轉速 220 r/min條件下振蕩培養165~175 h。30 L種子罐培養：取二級成熟種子瓶培養液，按1.0%接種比例接種子培養基 (20 L/30 L種子罐)，于溫度20.5±0.2 ℃、攪拌轉速350 r/min、通氣量比1.5 vvm、罐壓0.06 MPa條件下培養40 h。70 L發酵罐培養：將成熟種子罐培養液按10%移種比例移發酵罐 (25 L/70 L發酵罐)，培養溫度20.5±0.2 ℃、通氣比0.6～1.5 vvm、罐壓0.06 MPa，全程用25%～28%氨水控制pH值為5.00±0.02，攪拌轉速與溶氧聯動，關聯值為40%。定期取樣測定菌濃、碳源濃度和蝦青素產量。

(3)發酵優化方法

發酵培養基搖瓶正交優化：選取酵母抽提物、碳源 (葡萄糖：麥芽糊精：糖蜜=3:3:2)、蛋白胨、(NH4)2SO4、微量元素 (維生素溶液：金屬溶液=1:1)、乳酸和KH2PO4這7種主要培養基組份，作為正交試驗設計的因素。試驗采用7因素3水平正交試驗L18(37)，分析它們對蝦青素產量的影響。

(4)測定方法

菌體濃度檢測：對發酵液進行適當稀釋，測定波長600 nm處吸光度，根據光密度與細胞干重 (g/L) 的比值為2.50±0.10，確定細胞干重。

蝦青素HPLC法檢測：取1 mL發酵液，12 000 r/min 離心3 min，去離子水洗滌3次，離心獲得菌體。用二甲亞砜 (DMSO) 法破壁，由丙酮抽提至菌體為白色，用容量瓶定容、稀釋至適當倍數，使用參考文獻[6]的HPLC法，測定蝦青素含量。

總糖/還原糖檢測：按照菲林試劑法測定[7]。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基搖瓶正交試驗優化

根據已報道的培養基組份優化[8-9]和前期本司關于大宗碳源篩選的試驗結果，為綜合考察多種因素對法夫酵母XC3015發酵產蝦青素的影響，選取酵母抽提物、微量元素 (維生素溶液∶金屬溶液=1∶1)、碳源 (葡萄糖∶麥芽糊精∶糖 蜜=3∶3∶2)、(NH4)2SO4、蛋 白 胨、乳 酸 和KH2PO4這7種主要培養基組份，采用7因素3水平正交表L18(37) 進行水平組合處理設計，正交試驗數據分析如表1所示。

由表1實驗結果表明，在所設定的試驗條件下，各因素影響蝦青素產量水平的主次順序為：A>C>E>D>B>G>F，即碳源>酵母抽提物>乳酸>(NH4)2SO4>蛋白胨>KH2PO4>微量元素，蝦青素生產的優選發酵條件為A2B1C2D3E1F3G2，即 (g/L)：碳源 30，蛋白胨 1，酵母抽提物 3，(NH4)2SO47，乳酸 3，微量元素 12.5 mL，KH2PO41.0，最高蝦青素產量為47.5±0.32 μg/mL。

表1 法夫酵母XC3015發酵生產蝦青素正交試驗結果

2.2 補料搖瓶補糖工藝優化

補料搖瓶補糖工藝優化：校正補料泵的補料速率，設置補料時間和補料間隔實現定時定量補加。補糖1、補糖2、補糖3和補糖4，于24 h開始補加40%碳源，補糖間隔分別為4 h、8 h、12 h和16 h，單次補糖濃度(相對于起始體積，下同)分別為10 g/L、20 g/L、30 g/L和40 g/L，補糖總量(相對于起始體積，下同)均為360 g/L。補糖5、補糖6、補糖7和補糖8，于24 h開始分別補加26.7%、33.3%、46.6%和53.3%碳源，補糖間隔分別為6.0 h、4.8 h、3.4 h和3.0 h，單次補糖濃度均為10 g/L，補糖總量分別為240 g/L、300 g/L、420 g/L和480 g/L。

根據上述發酵培養基搖瓶實驗結果及關于碳源濃度、補糖控制和法夫酵母克勒勃屈利效應 (Crabtree effect) 對法夫酵母蝦青素生產影響的相關報道提示，必須對法夫酵母發酵過程補糖濃度、補糖總量等關鍵工藝參數進行考察。為此，在更接近于發酵罐培養模式的補料搖床上設置初始糖濃均為30 g/L，采用8種不同補糖方式考察碳源補加次數、補加時間和補加總量對法夫酵母產蝦青素的影響，結果如圖1所示。

從圖1可知，在補糖總量相同的條件下，補糖間隔越短、單次補糖濃度越低，法夫酵母的菌體濃度和蝦青素產量越高，在單次補糖濃度為10 g/L，補糖總量為360 g/L時，菌體干重和蝦青素產量分別為72.8±0.7 g/L和233.4±3.1 μg/mL，較單次補糖濃度40 g/L，補糖總量360 g/L時，分別高30.9%和45.41%。設定單次補糖濃度為10 g/L時，隨著補糖總量的增加法夫酵母菌體干重和蝦青素產量提高，但補糖總量超過420 g/L時菌體干重和蝦青素產量明顯下降。因此，補料搖瓶中較佳的補糖總量為420 g/L。

圖1 補糖方式和補糖總量對法夫酵母蝦青素生產的影響

2.3 70 L發酵罐工藝驗證

將三角瓶獲得的發酵培養基優化配方和補料搖瓶上補糖實驗結果在70 L發酵罐上進行發酵工藝驗證。比較優化前后法夫酵母菌體干重、蝦青素產量、干菌體蝦青素含量等相關參數，結果如表2所示。

表2 70 L發酵罐法夫酵母發酵工藝驗證

比較法夫酵母70 L發酵罐發酵工藝優化前后蝦青素生產實驗結果可以得出，優化后法夫酵母菌體干重達到107.7±1.6 g/L，較優化前提高15.4%，蝦青素產量達到515.6±2.4 μg/mL，較優化前提高31.9%，干菌體蝦青素含量達到4.78 mg/g(細胞干重)，較優化前提高14.1%，耗糖總量較優化前降低14.3%。

3 結語

試驗考察的7個影響法夫酵母蝦青素生產的因素按主次順序以及影響由大到小排列為：碳源>酵母抽提物>乳酸>(NH4)2SO4>蛋白胨>KH2PO4>微量元素。在補料搖瓶上優化的補糖工藝為單次補糖濃度10 g/L，補糖總量為420 g/L。將上述獲得的發酵配方和補料工藝在70 L發酵罐上進行驗證，蝦青素產量達到515.6±2.4 μg/mL，較優化前提高31.9%。