烤煙植株磷對礦質養分轉運基因表達的影響及調控途徑

潘曉英，陳俊標，李集勤，馬柱文，徐婷裕，楊少海，黃振瑞

（廣東省農業科學院作物研究所/廣東省農作物遺傳改良重點實驗室/廣東省煙草育種與綜合利用工程技術研究中心，廣東廣州 510640）

煙草不僅是科學研究領域的重要模式植物，也是重要的經濟作物，在我國的種植面積約有100萬hm2。在生產上通常采取打頂和控制腋芽發生，使煙株在后期生長過程中將能量轉移至葉片，促進煙葉產量最大化[1–2]。氮、磷和鉀的供應在煙株的栽培過程中起著非常重要的作用。磷對煙葉成熟期的色澤形成以及烤后的煙葉品質具有重要影響，缺磷會延緩煙葉的成熟，并降低葉片中氮和鎂的濃度[3]。過量供磷通常不會增加產量，反而會降低煙葉質量，出現葉片干燥和不規則的葉片形態[4]。過量施用磷肥還會導致環境污染與中微量元素缺乏等問題[5–6]。因此，探究煙株生長過程中磷養分的分配規律，對實現煙葉生產的高產高效具有重要意義。

植物體內養分間的關系十分復雜。研究發現，擬南芥在長期缺磷或低磷脅迫條件下，葉片中的鉀濃度顯著降低，并誘導編碼鉀轉運蛋白基因的上調表達[7]。同樣，在低鉀的生長環境下，煙株體內的磷轉運蛋白基因也顯著上調[8]。此外，研究發現，增加鈣養分的施用會降低煙株體內磷養分的濃度[9–10]。其次，磷養分與其他微量元素之間也存在復雜的交互作用。首先，磷和鋅養分之間的交互作用研究較多。供磷水平增加會導致鋅含量降低，如在小麥、玉米、大豆、棉花和番茄等多種作物中，隨著磷肥施用量增加，作物體內磷濃度升高，但鋅濃度顯著降低[11–14]。而大麥的相關研究中，在正常供磷和低磷條件下，缺鋅會上調磷轉運蛋白的表達[15]。雖然錳是一種類似于鋅的二價陽離子，但研究發現，磷會促進番茄對錳的吸收[11]。此外，研究發現，缺磷處理會導致幼苗期的擬南芥和水稻體內鐵養分積累[7, 16–17]。缺磷會誘導大豆體內銅轉運蛋白基因的上調表達[18]。這些結果綜合表明，植物體內磷養分與其他養分之間存在復雜的交互作用，且磷養分與其他養分交互作用情況存在物種差異性。更重要的是，煙草中磷養分與其他養分的交互作用以及分子水平的相關研究尚未見具體報道。

鑒于磷在煙株生長發育過程中的重要作用，解析煙株體內磷營養分配規律及其與其它養分間的交互作用，為磷肥配合其他養分施用提供理論基礎具有重要意義。本研究通過不同供磷處理，解析低磷與過量供磷對煙株體內的磷以及其它養分的濃度、含量以及分配規律的影響。其次，我們結合前期已有的轉錄組數據，篩選出86個養分轉運相關的基因在啟動子區域（2 kb）含P1BS轉錄元件，并對其中12個基因進行RT-qPCR驗證。此外，我們結合分子生物學方法，鑒定到鉀轉運蛋白和鎂轉運蛋白基因受NtPHR2的直接調控。本研究結果將為改進煙葉生產中磷肥施用的管理策略提供理論基礎，以最大限度地提高煙葉生產水平。

1 材料與方法

1.1 植物培養與生長條件

供試材料為我國的煙草主栽品種K326 (Nicotiana tabacumL. cv. K326)。將 K326 包衣種子播入泥炭、蛭石、珍珠巖(3∶1∶1, V∶V∶V)混合基質的漂浮苗盤中進行育苗，培養60天挑選長勢一致的健壯煙苗，去除根部雜質，移栽至容量為4 L的塑料花盆，容器下部有孔，以便多余的水分漏出，底部墊尼龍網，防止漏砂。盆內含2 L石英砂(0.1%的鹽酸浸泡后去離子水洗晾干)，粒徑為0.2～0.4 mm，表面覆蓋一層陶粒，保持水分并避免產生綠藻。植物生長室條件：日光溫室，晝夜溫差為22℃～30℃。

培養過程中澆Hoagland營養液，具體配方為：3 mmol/L KNO3、2 mmol/L Ca (NO3)2、1 mmol/L KH2PO4、0.25 mmol/L MgSO4、25 μmol/L KCl、12.5 μmol/L H3BO3、1 μmol/L MnSO4、1 μmol/L ZnSO4、0.25 μmol/L CuSO4、0.25 μmol/L (NH4)6Mo7O24和 0.1 mmol/L Fe-EDTA。因此，對照條件磷濃度為1 mmol/L KH2PO4。低磷處理中磷濃度為 0.1 mmol/L KH2PO4，其余鉀離子由KCl替代補齊。高磷處理中磷濃度為 5 mmol/L NaH2PO4，缺失的鉀由 KCl替代補齊。移栽后，澆1/4的營養液300 mL，隔天澆一次。培養至7天，隔天澆1/2的營養液300 mL。培養至14天，澆全營養液，每天澆一次500 mL，每次澆完營養液將滲出的液體倒掉。每周澆一次去離子水1 L (避免鹽害)。培養至28天開始不同供磷處理，每個處理7盆。培養至35天對煙株進行打頂(模擬生產實踐)后繼續培養至42天收獲樣品，收獲前拍照記錄。

1.2 樣品收獲與養分測定

收獲提取總RNA樣品：將煙株的根、莖、葉和腋芽，用鋁箔紙包裹后立即在液氮中速凍，隨后保存于－80℃備用。

收獲用于測定養分濃度的樣品：根、上部葉(從上往下4片葉)、下部葉(除去上部4片葉的全部葉片)、上部莖(上部葉對應的莖部)、下部莖(下部葉對應的莖部)、腋芽，分別用自來水洗滌，再用去離子水洗滌后放入烘箱(105℃)殺青0.5 h后，65℃烘干至恒重，稱重記錄，隨后用不銹鋼粉樣機磨碎用于測定養分含量。

樣品分析時，首先加入HNO3–H2O2，用微波消解儀 (CEM, Matthew, NC, USA)對樣品進行消解。然后運用電感耦合等離子發射光譜儀(ICP-OES, OPTIMA 3300 DV, Perkins-Elmer, USA)對消解液中的養分濃度進行測定。整個分析過程中，用標準樣品IPE684和IPE126對消解過程和測定過程進行質量監控。

1.3 啟動子序列中含有磷調控順式元件P1BS的基因鑒定

基于本團隊前期已積累的根部轉錄組數據(PRJNA 649315)，運用自定義Perl腳本在轉錄起始位點上游2 kb序列區域內，搜索磷調控順式元件P1BS(5′–GNATATNC–3′)，統計分析其數量和所在位置[19]。

1.4 實時熒光定量PCR分析(RT-qPCR)

RNA提取采用Trizol法(Invitrogen)。隨后，運用 Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time, Takara)進行 cDNA 合成。合成的cDNA 經過 5 倍稀釋后體積為 100 μL，取 2 μL 用于25 μL體系PCR反應?；蛱禺愋砸镆姼奖?。PCR反應程序為：95℃預變性2 min，40個循環程序 (95℃ 變性 15 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s)[20]。數據處理運用比較CT值法計算基因的相對表達量[21]。每個處理至少3個生物學重復和3個技術重復，同時設置陰性對照，采用泛素連接酶基因(evm.TU.HIC_ASM_12.2258)為內參對照。

1.5 酵母單雜與原生質體瞬時轉化、EMSA

首先，酵母單雜部分，運用附表1的引物構建pAbAi酵母重組質粒，測序后利用BstBI線性化載體轉入Y1HGold菌株，獲得重組酵母菌。涂布于SD/-Ura/AbAn上篩選抑制各個酵母菌生長的金擔子素(aureobasidin A，簡稱AbA)最低濃度。進一步利用重組酵母菌株制備感受態，并將NtPHR2-pGADT7(NtPHR2-AD) 轉化感受態。得到含有靶基因和順式元件的重組酵母菌，涂布于含有相應AbA背景濃度的培養基SD/-Leu/AbAn上，30℃倒置培養觀察。其次，進行原生質體轉化與雙熒光素酶(dual luciferase reporter gene assay, LUC)分析，

將NtPHR2的編碼序列克隆到載體pGreen ∥ 62-SK (效應子，effector)中，同時將靶基因的～1500-bp 啟動子序列克隆到載體 pGreen II 0800-LUC (報告子，reporter)中，測序驗證后，共轉原生質體。同時以 pGreen ∥ 62-SK (效應子，effector)空載體與連接靶基因啟動子的 pGreen II 0800-LUC (報告子，reporter)重組載體共轉原生質體作為對照。后續實驗運用酶標儀，參考本小組原有的標準方法測定螢火蟲螢光素酶(LUC)和海腎螢光素酶(REN)的活性，計算LUC/REN值，具體步驟參見相關文獻[22]。

將重組載體PET28a-NtPHR2轉化大腸桿菌BL21，進行蛋白表達并純化(Ni-NTA 純化樹脂預裝柱C600791/C600793購自上海生工生物工程有限公司)。隨后進行探針準備，凝膠制備與跑膠，轉膜與交聯。最后進行膜封閉、抗體孵育以及顯色曝光獲取圖片等，按照試劑盒[LightShift?Chemiluminescent EMSA Kit (20148)與 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module (89880)購自 Thermo Fisher Scientific]進行[22]。具體采用的引物和探針序列見附表1。

1.6 統計分析

數據分析，采用SAS統計軟件包進行統計分析(SAS Institute Inc., 2001)。

2 結果與分析

2.1 低磷與過量供磷顯著抑制煙株生長

圖1結果顯示，與對照條件和高磷處理相比，低磷處理的煙株葉片淺綠，葉片較小且下部葉明顯衰老(圖1A)。其次，低磷處理的煙株根系生物量明顯偏少(圖1B)。

圖1 不同供磷水平下烤煙地上部和根系Fig. 1 The shoot and root of tobacco under different P supply levels

煙株收獲后，對其干物質量統計分析發現，低磷顯著抑制根部干物質量累積，但過量供磷并未增加根部干物質量(表1)。除莖和下部葉片外，低磷和過量供磷條件下的上部葉和腋芽干物質量累積顯著低于對照條件下(表1)。以上結果表明，不同供磷水平，顯著影響煙株根部和地上部干物質量。低磷向優化施磷(對照)的過程中，植株的干物質量呈顯著增加的趨勢，但過量施磷不會導致干物質量的進一步增加，反而會抑制煙株發育以及地上部干物質量累積。

表1 不同供磷水平下煙株各組織器官與整株干物質量 (g)Table 1 Dry matter of tobacco plant parts under differential P supply levels

2.2 供磷水平對煙株磷及其他礦質元素濃度的影響

隨著供磷水平從低(LP)、正常(對照)到高(HP)，煙株體內各組織器官中的磷濃度顯著提高(圖2)，只有腋芽組織中，低磷條件下的磷含量高于對照，這可能是由于磷從其他部位向幼嫩部位(營養中心)轉運增加。

本研究發現，低磷和高磷處理下的根系鉀濃度均低于對照煙株根系，但地上部各組織，高磷處理時鉀濃度隨之升高，包括下部莖和上部莖、下部葉片和上部葉片以及腋芽組織。同時，我們發現低磷處理煙株的根系和地上部葉片中的鈣濃度低于對照煙株。低磷處理的煙株根系和葉片（下部和上部）中鎂濃度低于對照煙株，但高磷不會降低煙株地上部組織中的鎂濃度，且發現高磷處理的煙株上部葉片和腋芽組織中鎂濃度高于對照煙株（圖2）。

圖2 不同供磷水平下煙株磷、鉀和鈣、鎂養分濃度Fig. 2 Concentrations of P, K, Ca and Mg in tobacco plant under different P supply levels

研究結果發現，低磷和高磷處理根系的微量元素鐵、銅和鋅濃度與對照無顯著差異。低磷處理下煙株根系中錳濃度低于對照及高磷煙株。低磷和高磷處理的煙株地上部葉片中鐵、鋅和錳的濃度均低于對照煙株，但銅濃度在對照和高磷處理間無顯著差異（圖3）。

圖3 不同供磷水平下煙株微量元素濃度Fig. 3 Micronutrient concentrations in tobacco plant under different P supply levels

2.3 供磷水平對煙株體內磷與其他礦質元素分配的影響

從表2結果可以發現，提高供磷水平顯著降低了地上部磷元素的分配。與對照和高磷處理相比，低磷處理根系中鈣、錳和鋅的分布顯著降低，表明常規和高磷處理促進了鈣、錳和鋅向地上部的轉移。低磷和高磷處理均會促進鎂和鉀向地上部轉移。供磷水平對鐵和銅元素的分配沒有顯著影響。

表2 不同供磷水平下煙株各組織器官中養分的分配率(%)Table 2 Distribution percentage of a nutrient in tobacco plant parts as affected by Papplication levels

2.4 啟動子區域具有P1BS順式作用元件的礦質養分吸收與轉運的相關基因篩選及其驗證

低磷處理時，植物會產生一系列復雜的系統信號以維持磷穩態，PHR是這一調控網絡的關鍵中心轉錄因子，主要通過與下游靶基因啟動子區域的P1BS(5′-GNATATNC-3′)順式作用元件結合調控其表達[23]。根中基因表達對磷營養變化的響應比地上部敏感，因此，我們運用前期已有根部轉錄組數據，篩選啟動子區域具有P1BS順式作用元件的基因。

經分析，煙株根部有12,850個基因在上游啟動子2 kb序列中具有P1BS順式作用元件，從中篩選出與養分吸收和轉運相關的基因86個(附表2)。從中挑選出12個磷、鉀、鈣、鎂以及鐵、銅和鋅轉運蛋白基因，分析它們在不同供磷水平處理的根系組織中的表達量。結果發現，其中兩個磷轉運蛋白基因在低磷和高磷處理時，均上調表達(圖4A、B)。在低磷和高磷處理時，兩個鉀轉運蛋白基因均上調表達(圖4C、D)。鈣和鎂轉運蛋白基因在低磷或高磷處理時，表達量上調(圖4E—G)。此外，其中的兩個鐵轉運蛋白基因，在低磷和高磷處理時，表達量也上調(圖4H、I)。其中一個銅轉運蛋白基因在低磷處理時上調表達，在高磷處理時下調表達(圖4J)。在低磷和高磷處理時，其中一個鋅轉運蛋白基因的表達上調，而另一個鋅轉運蛋白基因的表達量下降(圖 4K、L)。

圖4 熒光定量PCR驗證附表2中選取的12個基因對低磷和高磷的響應Fig. 4 RT-qPCR validation of expression levels of twelve selected genes in response to LP and HP

2.5 NtPHR2可直接調控鉀和鎂轉運蛋白基因

鉀和鎂轉運蛋白基因是否受NtPHR2直接調控，依次通過酵母單雜、原生質體瞬時轉化驗證，隨后設計生物素標記探針進行凝膠阻滯試驗(EMSA)，從體外證明NtPHR2能直接結合到鉀轉運蛋白(K+transporter/evm.TU.HIC_ASM_15.653)和鎂轉運蛋白啟動子 (CorA-like Mg2+transporter protein/evm.TU.HIC_ASM_3.60)(圖5)。因此，本研究結果證明，NtPHR2通過結合P1BS順式元件直接調控鉀和鎂轉運蛋白基因

3 討論

3.1 缺磷與過量供磷抑制煙株生長和地上部生物量積累

在本研究中，我們發現煙株對供磷水平非常敏感，低磷和高磷處理均顯著降低煙株地上部干物質量的累積，但高磷處理時，煙株根系干物質量與對照無顯著差異(表1)。正如我們預期，煙株對磷的吸收以及向地上部轉運量隨供磷水平增加而增加(圖2)，且過量供磷導致根系磷累積量的增加可能具有降低根系活力的毒性效應[11]。與已有田間試驗結果一致，小麥地上部生物量積累隨著施磷量的增加而增加，但過量施磷不會導致生物量的進一步增加[14]。

3.2 煙株體內磷養分與其他礦質養分之間存在廣泛的交互作用

在此研究中，我們發現隨著供磷水平增加，煙株體內磷與其他礦質養分濃度與交互作用隨之發生變化。同時，不同供磷水平對不同礦質養分的影響并不一致。

烤煙中鉀的含量是衡量煙葉品質的重要指標之一。我們的研究結果表明，高磷條件下煙株葉片中鉀濃度高于對照和低磷(圖2)。同時，低磷和高磷條件下根系中鉀的分配比例變低(表2)，表明低磷與過量供磷均會促進鉀從根系向地上部轉移。此外，煙株中鉀轉運蛋白基因啟動子中具有P1BS順式調控元件(附表2)，同時，其中兩個鉀轉運蛋白基因均上調表達(圖4C、D)，并有試驗證明其中一個鉀轉運蛋白基因受到NtPHR2的直接調控(圖5A)。這些結果綜合表明，煙株中鉀轉運蛋白直接響應磷脅迫，存在較強的交互作用。這與其他作物中的研究結果一致，包括水稻中鉀轉運蛋白基因受到低磷脅迫的強烈誘導[7]，以及煙株中磷轉運蛋白基因在缺鉀條件下顯著上調，包括PHO1、PHT1;8、PHT1;9和PHT4;5[8]。

與鉀的研究結果一致，高磷條件下的煙株葉片中鎂濃度高于對照，低磷條件下煙株葉片中鎂濃度最低。此外，我們篩選到11個鎂轉運蛋白基因具有P1BS順式調控元件(附表2)，同時，RT-qPCR分析驗證其中兩個鎂轉運蛋白基因，分別在低磷或高磷處理時，表達量上調(圖4F、G)，其中一個鎂轉白蛋白基因受到NtPHR2的直接調控(圖5B)，進一步說明磷和鎂之間存在直接的交互作用。磷和鈣是不相容離子，鈣可與磷及其衍生物形成不溶性化合物參與協調磷脅迫反應。前人研究發現，施用鈣肥會促進煙株葉片中鈣濃度升高，但會導致煙株中磷由根部向地上部葉片中的分配降低[10–11]。與此研究結果一致，本研究結果顯示低磷脅迫降低煙株根部和上部葉片中鈣濃度，并促進鈣從根部向地上部轉移(圖2和表2)。同時，高磷處理也降低煙株體內上部葉片的鈣濃度(圖3)。其次，我們也篩選到14個鈣轉運相關基因具有P1BS順式作用元件，并驗證其中鈣轉運蛋白基因(evm.TU.HIC_ASM_20.3333)在低磷和高磷條件下顯著上調(圖4E)，綜合表明磷和鈣相互作用調節養分水平參與煙株發育過程。實際上鎂作為幾種激酶的激活劑，能激活大部分涉及磷酸鹽轉移的反應[24]。并且從植物營養學角度看，鎂從根部到地上部的轉移依賴磷的供應[25]。研究也表明大豆中磷能促進鎂的吸收，磷鎂存在互作，并受到大豆的基因型影響[26]。花生中的研究也表明，磷鈣合理配施可提高花生磷鈣吸收效率[27]。因此，在農業生產中，進行磷肥、鎂肥和鈣肥的合理配合施用，更有利于煙草高產高效的栽培。

圖5 NtPHR2直接結合于鉀和鎂轉運蛋白基因啟動子中P1BS元件Fig. 5 NtPHR2 directly binds toP1BS in the promoter of K and Mg transporter genes

值得關注的是，不合理的供磷量也會顯著影響煙株體內微量元素的濃度。在小麥、玉米、大豆、棉花和番茄的相關研究結果中顯示，施磷量與磷濃度呈正相關，但與地上部鋅濃度呈負相關[12–15]。但研究結果也顯示，在不同物種不同生育期養分之間的交互作用表現并不完全相同。在本研究中，鐵、鋅和錳養分在地上部組織器官中受不同供磷水平影響表現相似。與對照相比，低磷和高磷處理的煙株上部葉片中鋅和錳濃度均顯著降低(圖3)。低磷脅迫促進鋅和錳由根部向地上部轉運(表2)。同時，我們篩選到13個鋅轉運蛋白基因具有P1BS順式作用元件(附表2)，并通過實驗驗證其中兩個鋅轉運蛋白基因受到低磷與高磷的顯著調控(圖4K、L)，進一步說明煙株中磷與鋅元素間存在交互作用。前人在大麥的研究中發現，缺鋅會誘導低磷和對照條件下的磷轉運蛋白基因的上調表達，從而促進地上部磷累積[16]。在番茄的研究中發現施磷會促進錳的吸收[12]，這與我們研究結果相反，再次表明各元素間的交互作用存在物種特異性。此研究結果將提示我們，與其他物種的響應不同，煙草中磷與錳元素存在拮抗作用，所以在煙草種植過程中，提高磷施用量可能會降低煙株錳的吸收。此外，我們的研究結果發現，與對照相比，低磷和高磷處理的煙株上部葉片的鐵濃度降低(圖3)。我們鑒定到4個鐵轉運蛋白基因具有P1BS順式調控元件(附表2)，并通過實驗驗證兩個鐵轉運蛋白基因，在低磷和高磷處理時，表達量顯著上調(圖4H、I)。這些結果說明磷和鐵在煙株中存在強烈的交互作用，磷養分失調將導致煙株缺鐵，可能促進鐵轉運蛋白基因表達量上調。但在擬南芥和水稻幼苗期，缺磷會導致鐵養分的顯著累積[8,17–18]。此外，研究也發現缺磷脅迫條件下，鐵轉運蛋白基因AtIRT1表達下降，通過生理數據分析發現這與缺磷植株中鐵濃度增加有關[28]。因此，煙株種植過程中，磷肥正常施用范圍內，可促進鐵的吸收，過量供磷脅迫可能對鐵吸收利用造成干擾，將導致煙株出現鐵吸收下降的現象。最后，我們發現，與對照相比，低磷處理的煙株地上部葉片的銅濃度降低(圖3)，且發現部分銅轉運蛋白基因具有P1BS順式調控元件(附表2)并受到低磷和高磷的差異調控(圖4J)。與此結果一致的是缺磷增加了大豆中銅轉運蛋白基因的表達[19]。

4 結論

我們的研究結果證明，除鉀和鎂外，煙株上部葉片中礦質養分的吸收受到過量供磷的負面影響，這些元素的調控基因對缺磷和磷過量均有一定的響應。結合已有的轉錄組數據，我們采用篩選順式調控元件(P1BS)和RT-qPCR驗證，鑒定到受NtPHR2基因直接調控的鉀轉運蛋白和鎂轉運蛋白。因此，磷對其他礦質營養的吸收利用的影響不僅限于土壤和根系。

附表 1 本研究中使用的引物序列Supplyment table 1 Primers used in this study

附表 2 含有P1BS順式調控元件并參與礦質營養物質吸收與轉運相關基因Supplyment table 2 List of genes harboredP1BS motif and involved in uptake and translocation of the mineral nutrients

續附表 2 Table 2 continued