螯合–緩沖營養液培養條件下添加外源鋅對小麥幼苗生長和TaZIPs基因表達的影響

李廣鑫，趙 鵬，睢福慶，劉紅恩，秦世玉，段 然，楊艷征，王 云，李 暢

（河南農業大學資源與環境學院/河南省土壤污染修復重點實驗室，河南鄭州 450002）

鋅(Zn)是動植物所必需的微量營養元素，在生長發育、生殖遺傳等生理過程中能夠激活促進與生長和代謝相關的酶，并產生在DNA復制和轉錄中發揮重要作用的含鋅金屬蛋白，從而控制相關基因的表達[1–2]。鋅通常以二價離子的形式被植物所吸收，外源供鋅可以有效提高作物的產量和鋅含量[3–4]。鋅缺乏和鋅過量的生理范圍較窄，一般莖葉中的鋅含量在 10～100 mg/kg，當超過 300 mg/kg 時，鋅的毒害作用較為明顯[5–6]。Broadley等[6]研究發現小麥中的鋅濃度會隨鋅供應的增加而顯著提高，過多的鋅致使大量的重金屬離子進入植物的原始平衡系統，導致代謝紊亂。侯雷平等[7]研究發現缺鋅或高鋅均會導致番茄葉片的葉綠素含量下降，而適量供鋅可促進植株根系伸長，根系活力增強；同時還可提高劍麻葉片葉綠素含量，增強光合作用，促進碳水化合物的合成和代謝[8]。

研究表明，植物本身為獲得適當的鋅營養也進化出了復雜的感知和響應機制[9]，如調節根對鋅的吸收，以減輕鋅有效性的變化[10]。植物體內的Zn2+平衡與鋅轉運蛋白基因家族密不可分，而ZIP轉運蛋白被認為是植物適應土壤中鋅有效性低和變化的關鍵基因[11–12]。植物的生長發育過程受到基因表達方式的嚴格調控。某些基因在植物生長的各個階段持續表達，其基因表達水平幾乎不受外界環境的影響，這類基因表達稱為組成型表達；與之相對的是一些基因表達極易受環境變化的影響，在特定的環境信號刺激下，這些基因被激活，基因表達產物增加，這種表達方式稱為誘導性表達。有報道稱，在中國春小麥(Triticum dicoccoides-nudigl)中，TaZIP3、TaZIP6、TaZIP7、TaZIP9和TaZIP13基因的表達受缺鋅誘導(也稱誘導性表達)[13]，這些基因的表達在一定程度上均會對作物的鋅肥利用率產生影響，但關于其受鋅影響的變化和作用機制尚不十分明確。

因此，本試驗通過采用螯合–緩沖營養液培養來模擬土壤缺鋅環境，研究不同供鋅水平對小麥的生長、光合作用、離子平衡以及ZIP轉運蛋白基因表達的影響，從生理和分子水平上揭示小麥植株體內鋅離子平衡的作用機制，以期為農業生產中鋅肥的平衡施用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試驗設計

供試小麥品種為‘百農207’。試驗選取顆粒飽滿、大小一致的種子，在10% NaClO溶液中浸泡消毒5 min，用自來水沖洗干凈后，再用蒸餾水和去離子水各清洗3次后，在去離子水中浸泡24 h，將吸脹后的種子放置在濕潤的棉紗上進行催芽。供試營養液為螯合–緩沖營養液[14]，其基本配方為：1.5 mmol/L KNO3、0.6 mmol/L NH4H2PO4、0.25 mmol/L MgSO4·7H2O、1.0 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、2.56 mmol/L MES (pH 為 6.1)、20 μmol/L EDTA-Fe、12.5 μmol/L H3BO3、3.0 μmol/L MnSO4、0.1 μmol/L H2MoO4、0.1 μmol/L NiSO4、2.8 μmol/L CuSO4·5H2O、50 μmol/L K3-HEDTA，營養液 pH 為 6.1。

試驗共設置5個營養液供Zn水平：0、0.05、0.25、1.0、2.5 mg/L，相當于 Zn 0、0.76、3.82、15.30、38.23 μmol/L，以 ZnSO4?7H2O 形式加入，各處理營養液要保持pH一致(通過NaOH和HCl調節pH)。選擇長勢一致的幼苗移栽到含有2 L螯合-緩沖營養液的黑色塑料容器中，每個塑料容器中種植10棵小麥苗。試驗在溫濕可控的人工光照培養室中進行，溫度為25℃±5℃，濕度75%±1%，光照/黑暗時間分別為14 h/10 h。待幼苗長至一葉一心時，首先使用1/4和1/2的螯合-緩沖營養液分別培養3天后，再選擇全營養液進行培養，同時進行供鋅處理，每個處理重復4次，每3天更換1次營養液。在配制鋅溶液時，要求ZnSO4?7H2O與等物質的量的K3-HEDTA混合平衡后使用。

試驗在鋅處理3周后收獲取樣，采集測定小麥植株長度、生物量、光合參數、鋅鐵等金屬離子含量等指標，部分樣品經液氮冷凍后保存于－80℃超低溫冰箱中。選擇0、0.25、2.5 mg/L供鋅處理下的小麥幼苗進行基因表達分析。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 根系形態及幼苗生長 處理14天時，每個處理隨機選取 4 株完整的小麥植株，采用根系掃描儀 (V700PHOTO, Epson, Japan)和數據分析軟件 Win RHI-ZO Version 2009 PRO (Regent Instruments,Quebec City, Canada)分別對根系總長 (RL)、根系表面積(RSA)、根體積(RV)和平均根直徑(RAD)進行掃描分析，測定根系形態。

在供鋅處理21天時，用刻度尺測量幼苗莖基部至頂端葉尖的長度，即為株高，根尖到幼苗莖基部的長度即為根長。將小麥植株在105℃下殺青30 min，70℃下烘干至恒重后，地上部和根部分開稱重。

1.2.2 光合參數 處理14天時，選取小麥幼苗完全展開的倒二葉，用便攜式光合測定系統(LI-6400XT, USA)測定葉片面積，根據葉面積換算得出小麥葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。

1.2.3 微量元素含量 將小麥地上部和根部粉碎后，采用 HNO3∶HClO4(87∶13，V/V)混酸提取，石墨消解爐 (EHD36，Lab Tech Ltd, USA)消解，原子吸收分光光度法 (ZEEnit 700；Analytik. Jena AG，Germany)測定小麥Zn、Cu、Fe、Mn含量。

1.2.4 RNA 提取及實時熒光定量 PCR (qRT-PCR)用Trizol試劑(Invitrogen, USA)提取小麥根部和地上部的總RNA，去除基因組DNA后，使用 M-MLV逆轉錄酶(Fermentas，USA)和dT18寡核苷酸引物將 RNA 反轉錄為 cDNA。使用 ABI Quant Studio 3 實時熒光 PCR 系統和 SYBR Green Kit (Takara)進行實時 qRT-PCR。PCR 條件為預變性 95℃ 30 s，40 個循環 95℃ 10 s，60℃ 30 s，融解曲線 95℃ 15 s，60℃60 s，95℃ 15 s。3 個生物重復被用于轉錄分析，每個cDNA 樣本進行了3次技術重復。相關基因的引物序列見表1。

表1 引物序列與相關信息Table 1 Sequences and related information of primers used in this study

1.3 數據統計與分析

所有試驗均采用完全隨機設計，重復4次。試驗數據使用Microsoft Excel進行統計，采用SPSS 22.0 (Chicago, USA)軟件進行方差分析和差異顯著性分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法進行多重比較(P<0.05)，使用Sigmaplot 10.0作圖。

2 結果與分析

2.1 不同供鋅水平對小麥幼苗生長的影響

由圖1可知，隨著供鋅濃度的增加，小麥幼苗的根長和株高呈先升后降的趨勢，以Zn0.05處理的小麥幼苗的根長和株高最大，分別為46.18和35.47 cm，是Zn0處理的1.24和1.22倍；隨著供鋅濃度的進一步增加，小麥幼苗的根長和株高呈下降趨勢，但仍高于Zn0處理，其中，Zn0.05與Zn0.25處理的根長無顯著性差異。

圖1 不同供鋅水平下小麥幼苗的生長情況Fig. 1 Growth of wheat seedlings under different Zn levels

2.2 不同供鋅水平對小麥幼苗生物量的影響

由圖2可知，無論供鋅水平如何，小麥幼苗的地上部干重均高于根部。小麥幼苗的干重在Zn0.05處理時達到最大，隨著供鋅濃度的進一步增加，呈下降的趨勢。與Zn0處理相比，供鋅后(Zn0.05、Zn0.25、Zn1.0、Zn2.5)的小麥幼苗根部干重分別提高了35.91%、20.19%、–1.05%、–13.89%，地上部干重分別提高了34.39%、16.66%、–2.55%、–8.08%。隨著供鋅濃度的進一步提高，小麥幼苗干重呈下降趨勢，且對根部干重影響較大。缺鋅（Zn0）和高鋅（Zn1.0、Zn2.5）處理下小麥幼苗的生物量較Zn0.05處理下降了25.6%～31.6%。可見，常規供鋅濃度(0.05、0.25 mg/L)可以顯著促進小麥幼苗的生物量累積，而高鋅則會顯著抑制小麥的生長發育，這與鋅對小麥幼苗根長和株高的影響基本一致。

圖2 不同供鋅水平下小麥幼苗的生物量Fig. 2 Biomass of wheat seedlings under different Zn levels

2.3 不同供鋅水平對小麥幼苗根系形態的影響

如表2所示，小麥幼苗的根部總根長、表面積、體積和平均直徑均隨著供鋅水平的提高呈先增后降的趨勢，小麥幼苗的總根長在Zn1.0處理最大，根表面積、根體積、根平均直徑均在Zn0.25處理下達到最大。常規鋅（Zn0.05、Zn0.25）處理下根系形態指標較Zn0處理增加了0.30%～27.0%。而Zn0以及Zn2.5處理下根系形態指標較Zn0.25處理下降了1.3%～21.2%，顯著抑制了幼苗的根系形態發育，影響到了地上部的生長。

表2 不同供鋅水平下小麥幼苗的根系形態Table 2 Root morphology of wheat seedlings under different Zn levels

2.4 不同供鋅水平對小麥幼苗鋅含量和鋅累積量的影響

由圖3可知，小麥幼苗的鋅含量和鋅累積量均隨供鋅水平的升高而增加。Zn0.05、Zn0.25、Zn1.0、Zn2.5處理的小麥幼苗根部的鋅含量較Zn0處理分別增加了125.01%、138.32%、533.99%、1047.97%，地上部分別增加了170.54%、226.27%、491.26%、656.44 %；同樣，根部鋅累積量較Zn0處理分別增加了213.40%、188.34%、538.59%、1015.01%，地上部分別增加了219.08%、280.40%、474.14%、614.39 %。小麥幼苗鋅含量和鋅累積量均表現為根部>地上部。

圖3 不同供鋅水平下小麥幼苗各器官的鋅含量和鋅累積量Fig. 3 Zn content and accumulation in the roots and shoots of wheat seedlings under different Zn levels

小麥幼苗體內的鋅轉運系數在Zn0.25處理下最高，為Zn0處理的1.37倍(圖4)。高鋅(Zn1.0、Zn2.5)處理下，轉運能力顯著低于常規供鋅(Zn0.05、Zn0.25)處理，緩解了對地上部的毒害作用。

圖4 不同供鋅水平下小麥幼苗體內的鋅轉運系數Fig. 4 Zn translocation factor in wheat seedlings under different Zn levels

2.5 不同供鋅水平對小麥幼苗體內Cu、Fe、Mn吸收的影響

如圖5所示，小麥幼苗體內的Cu、Fe、Mn含量顯著受到供鋅濃度的影響。Zn0處理下小麥體內的Cu、Fe、Mn吸收最高，隨著供鋅濃度的增加，Cu、Fe、Mn吸收呈下降趨勢。小麥幼苗根部的Mn吸收較Zn0處理降低了19.13%～49.14%，地上部降低了6.70%～18.92%；根部Fe吸收降低了50.49%～78.66%，地上部降低了14.32%～34.01%；根部Cu吸收降低了34.21%～44.33%，地上部降低了19.80%～32.12%。可見，在小麥幼苗的體內，金屬離子Cu、Fe、Mn與Zn之間存在著拮抗作用，且Zn對Fe的拮抗能力顯著強于對Cu和Mn。

圖5 不同供鋅水平下小麥幼苗根部和地上部Cu、Fe、Mn吸收量Fig. 5 Cu, Fe, and Mn uptake in roots and shoots of wheat seedlings under different Zn levels

Zn含量與Cu、Fe、Mn含量之間存在負相關關系(表3)。根系Zn含量與Cu、Fe、Mn含量的相關系數(r)分別為–0.73、–0.74、–0.79，均達到0.05水平，而地上部之間的相關系數分別為–0.66、–0.81、–0.85，與Cu含量之間的相關性不顯著，而與Fe和Mn的負相關性達到0.01水平。這些結果進一步證明了在小麥幼苗體內Zn與某些金屬離子之間存在著拮抗機制。

表3 不同供鋅水平下小麥根部和地上部鋅與銅、鐵、錳含量之間的相關性分析Table 3 Correlation of Cu, Fe, and Mn content with Zn content in the root and shoot of wheat seedlings

2.6 不同供鋅水平對小麥幼苗葉片光合參數的影響

由圖6可知，小麥幼苗的光合參數隨供鋅濃度的增加呈先增后降的趨勢，且均在Zn0.25處理達到最大。隨著供Zn濃度的增加，葉片氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)較Zn0處理分別提高了42.86%～58.11%、40.39%～55.40%；常規供鋅(0.05、0.25 mg/L)水平時，胞間CO2濃度(Ci)和凈光合速率(Pn)較Zn0處理分別提高了3.55%～8.66%、10.07%～15.97%。而高 Zn (1.0、2.5 mg/L)供應后，葉片的光合參數 (Gs、Tr、Ci、Pn)較Zn0.25處理分別下降了6.22%～9.64%、5.00%～9.66%、14.07%～16.69%、8.15%～10.51%。由此可知，適量的供鋅濃度有利于提高小麥幼苗的光合能力，促進干物質重的累積，但并非越高越好。

圖6 不同供鋅水平下小麥幼苗葉片的光合參數Fig. 6 Photosynthetic parameter of wheat seedlings under different Zn levels

2.7 鋅對小麥幼苗體內Zn2+平衡關鍵基因表達的影響

根據小麥相關生理指標結果的分析，選用0、0.05、2.5 mg/L這3個供鋅濃度測定小麥根部和地上部TaZIP3、TaZIP5、TaZIP6、TaZIP7和TaZIP13的基因表達量(圖 7)。可知，TaZIP3、TaZIP5、TaZIP7和TaZIP13在根系和地上部的基因表達量均在Zn0時最高，在Zn2.5時最低，TaZIP7和TaZIP13在地上部的基因表達趨勢與根系一致，而TaZIP3和TaZIP5在地上部的表達幾乎不受鋅濃度變化的影響。表明這些基因顯著受缺鋅信號調控，缺鋅誘導了小麥上調這些基因的表達量。TaZIP6在根系中呈組成性表達，其相對表達量幾乎不受供鋅濃度的影響，而在地上部的相對表達量則隨供鋅濃度的提高而增加，表明其主要作用與其他幾個基因不同，可能主要參與了鋅的轉運。

圖7 不同外源供鋅水平下小麥幼苗根部和地上部Zn2+平衡關鍵基因的相對表達量Fig. 7 Relative expression of genes related to Zn2+ homeostasis in the roots and shoots of wheat seedlings under different exogenous Zn supply levels

3 討論

鋅的缺乏和過量都會影響植物的生理代謝[15]，降低作物幼苗的生長速率和干重[16]。本試驗中，無外源鋅處理(Zn0)和高鋅處理(Zn1.0、Zn2.5)下，小麥幼苗生長、根系發育以及干物質重均低于常規供鋅水平(Zn0.05、Zn0.25)處理，顯示了一定的抑制效果，這與邢飛等[17]、閆志剛等[18]、韓金玲等[19]研究結果相一致。多項研究表明，施鋅能明顯提高小麥植株中的鋅含量，促進鋅在植株中的積累[3–4, 7, 16]。姜麗娜等[20]研究發現，外源鋅供應能夠明顯提高小麥幼苗根和芽中的鋅含量和鋅累積量；汪洪等[21]也發現施鋅提高了玉米植株中的鋅濃度和吸收量，促進了鋅向地上部的轉運。本研究證實了供鋅可以明顯提高小麥幼苗根部和地上部的鋅含量和鋅累積量，這一結果與Cherif等[22]在番茄上的研究結果相一致。同樣，有研究表明，植株地上部的鋅含量通常在10～100 mg/kg，且含量超過300 mg/kg時，作物會出現毒害癥狀[6]。而在本研究中，小麥幼苗地上部鋅含量在高鋅(2.5 mg/L)水平下達到了364.17 mg/kg，但未表現出明顯的毒害癥狀，這可能與根系作為植物貯藏器官的作用有關[23]，導致大量鋅在根部累積，減輕了地上部的鋅毒害。

鋅、銅、鐵、錳是植物必需的微量元素，它們在植物體內的穩態具有十分重要的作用[24]。本研究中，Zn與Cu、Fe、Mn的吸收在小麥苗期存在著明顯的拮抗作用，隨著施鋅濃度的增加，小麥幼苗體內的鋅含量和累積量顯著提高，但Cu、Fe、Mn的吸收顯著減少，以往研究也發現在大多數作物中Zn與Cu、Fe、Mn的吸收存在著相互拮抗作用[25–26]，而這種拮抗的產生可能是由于Zn和其他金屬離子與氨基酸結合于同一位點上[27]。高鋅供應會干擾植物體內其他金屬離子的吸收、轉運和分配，影響植株體內離子的平衡系統[28]。在本研究中，鋅供應后，小麥幼苗根部的Mn、Fe、Cu含量較Zn0處理顯著下降，且Fe含量的下降幅度最大。這可能是由于“稀釋效應”，施鋅促進了干物質的大量累積，從而進一步導致了其他必需微量營養元素含量的下降[29]。

光合參數是植株生長發育的基礎，鋅的缺乏和過量均會破壞葉肉細胞從而引起光合系統的氧化損傷，導致光合能力下降[30]。光合速率和蒸騰速率是衡量光合作用能力和蒸騰作用強弱的重要指標，其中，胞間CO2濃度(Ci)直接關系到光合速率的變化，而氣孔導度(Gs)會直接影響到蒸騰速率。鋅缺乏或鋅過量均會導致植物體內碳酸酐酶和羧化酶的活性降低，產生，光氧化傷害加重，導致細胞內CO2濃度下降和葉片氣孔導度降低，引起植物的光合能力下降[31]。本試驗中，常規鋅供應后增加了胞間CO2濃度(Ci)，提高了光合速率，葉片的氣孔導度(Gs)也有所升高，導致葉片的蒸騰速率提高，這一結果與杜新民等[32]在小白菜上的研究結果和Sagardoy等[33]在甜菜上的研究結果相一致。

本研究中，小麥對鋅素的缺乏和過量都顯示了一定的反應。鋅缺乏條件下，小麥的生長發育沒有受到明顯地抑制，可能是由于處理的時間較短(21天)以及小麥籽粒中本身含有鋅，對外源鋅的供應需求較小。此外，鋅缺乏顯著提高了小麥幼苗體內ZIP基因 (TaZIP3、TaZIP5、TaZIP7、TaZIP13)的表達，促進了鋅的吸收利用和轉運(圖7)。目前，在六倍體小麥中共鑒定出了14個TaZIPs基因，而受缺鋅誘導的TaZIPs基因表達結果表明ZIP成員可能在鋅的吸收和轉運中發揮著重要作用[13]。其中有許多作物中的ZIP轉運蛋白已經被證明參與了植物體內的鋅離子平衡，如：水稻[34]、擬南芥[35]、大麥等[36]。ZIP3、ZIP5、ZIP6、ZIP7和ZIP13屬于已經被證實來自擬南芥、水稻和大麥的鋅轉運ZIP基因系統發育的主要分支，但在小麥中幾乎還未被研究[13]。在本研究中，TaZIP3、TaZIP5、TaZIP6、TaZIP7和TaZIP13的基因表達在小麥幼苗的根系和地上部均被檢測到，且缺鋅顯著誘導了TaZIP3、TaZIP5、TaZIP7和TaZIP13在小麥體內的高表達，表明這些基因受到缺鋅信號的顯著調控，其主要功能可能參與植物養分供應不足時鋅的吸收過程。有研究發現，在水稻中，OsZIP3在薄壁細胞和木質部轉移細胞中表達，可能負責鋅在水稻發育組織中的優先分配[37]，而OsZIP4在根和莖中都有表達，可能參與了鋅的轉運和再分配[38]；在大麥中，HvZIP3和HvZIP5的轉錄水平受到鋅缺乏所誘導[39]；在野生二粒小麥中，TdZIP1(TaZIP3同源)會在缺鋅條件下高度表達[40]。TaZIP7與AtZIP4、AtZIP9、OsZIP7和OsZIP7a密切相關[13]，其中，AtZIP4在擬南芥的根和莖中都有表達，然而它的表達沒有逆轉鋅在酵母突變體中(ZHY3和DEY1453)的活性[41]，而OsZIP7和OsZIP7a在水稻的莖中受到缺鋅誘導，可能參與了鋅的轉運過程[42]。TaZIP13與HvZIP13、OsZIP8屬于最接近的同源基因[13]，其中OsZIP8參與水稻中鋅的吸收和分配[43]，而HvZIP13可能直接參與大麥中鋅的運輸或在低鋅條件下被誘導[44]。本研究中，鋅供應降低了TaZIP3、TaZIP5、TaZIP7和TaZIP13在小麥中的表達量。TaZIP6在根系中呈組成性表達，幾乎不受外界鋅含量變化的影響，而在地上部，其表達量隨供鋅水平的提高逐漸升高，表明其可能主要參與了鋅的轉運過程(圖7)。Evens等[13]也發現TaZIP6和TaZIP13在小麥根系和莖中的表達模式完全相反。由此可知，TaZIPs基因對于維持小麥植株體內鋅離子平衡穩態方面發揮了關鍵的作用。結合供鋅對小麥幼苗各部位離子含量與鋅轉運系數的影響，表明植物通過調控TaZIPs基因的表達進而調控鋅的吸收以及向地上部的轉運，從而改變了鋅在植株體內的分布，保證了植物的正常生長發育。

4 結論

適量供鋅明顯改善小麥的光合作用、根系形態以及離子平衡等，從而促進小麥的生長發育，積累更多的干物質。缺鋅與過量均會抑制小麥幼苗的生長發育，但小麥適應缺鋅與過量的機制不完全一致。缺鋅會上調小麥體內鋅離子相關基因的表達量來提高對鋅的吸收利用和轉運；鋅過量會減少小麥對Fe、Mn、Cu等微量元素的吸收，以維持小麥體內膜內外的離子平衡，同時，減少了鋅向地上部的轉運，緩解了鋅的毒害。