竹炭和竹炭包膜復合肥對毛竹林土壤磷有效性的影響及其微生物學機理

朱青和，馬 壯，裘 立，董 達*

（1 浙江農林大學環境與資源學院，浙江杭州 311300；2 浙江傳超環保科技有限公司，浙江杭州 311122；3 浙江玉禾相約農業開發有限公司，浙江杭州 311300）

磷是植物生長發育所必需的營養元素，參與植物體內的各種生物化學過程，對植物的生長發育和新陳代謝起著不可替代的作用[1]。為了促進作物生長，保障糧食安全，化學肥料特別是磷肥被大量使用。據世界糧農組織(FAO)“展望2030世界肥料趨勢”報告指出，2019年全球磷肥消耗量為5135萬t，并且以每年2%的速度增長。但是，磷在土壤中極易被固定，向土壤中施加的磷會與土壤礦物結合，造成作物對磷利用率的降低，通常土壤中磷的當季利用率只有10%～25%[2–4]。此外，磷肥的大量使用也極易增加土壤磷素流失風險，造成目前日益嚴重的水體富營養化問題[5–7]。

土壤中的磷素轉化過程主要由微生物介導，涉及多種功能基因，包括參與無機磷溶解和有機磷礦化基因，磷吸收和轉運的基因和磷饑餓反應調節的基因[8]。土壤中大量的有機磷只有當其被酶礦化成無機磷后，才能被植物吸收和利用。酶主要由土壤微生物分泌，在土壤磷元素代謝過程中起著非常重要的作用。含有編碼堿性磷酸酶基因(phoD、phoA和phoX)和C-P裂解酶基因(phnGHIJLM)的微生物具有礦化土壤有機磷的能力[9]。與phoD相比，我們對phoX和phoA了解并不多[10]。其中，phoD基因被認為是土壤中最重要的磷酸酶基因，在酸性、堿性和中性土壤中均可以被檢測到[10–12]。因此，phoD基因常被選擇作為研究土壤磷酸酶狀況的功能基因。微生物同化無機磷也需要相應的功能基因參與。其中，含有編碼磷吸收和轉運蛋白酶的pst和pit分別可以在低磷和富磷條件下同化無機磷[13]。參與磷饑餓反應調節基因(phoU、phoR和phoB)使微生物能夠利用外部磷源[8]。這些基因，在pst基因的調控下緊密相連，并控制堿性磷酸酶基因(phoD)的表達[14]。

毛竹是我國栽培歷史最為悠久、面積最廣和經濟價值最高的亞熱帶主要林分，廣泛分布于我國長江流域和南方各省區。然而，南方丘陵地帶土壤普遍缺磷少鉀[15]。大部分農林土壤中有效磷的含量僅為10 mg/kg，遠低于世界農林土壤的平均水平。為了提高我國農林土壤的磷素水平，在毛竹林的經營過程中往往采用集約化的經營管理模式[16]。竹林生態系統中有效磷含量已成為制約毛竹增產的主要限制因子。生物炭是植物生物質在完全或部分缺氧的條件下，經熱解炭化產生高度芳香化的固態物質，具有高度的穩定性，巨大的比表面積和孔隙率等特性，在改良土壤、固碳減排和緩解土壤養分流失等方面具有巨大的潛力，已成為國內外研究的熱點[17–19]。但是，生物炭單獨施用，養分供應不足，與常規肥料相比存在作物減產的風險[20–21]。因此，以常規肥料為基質，采用生物炭包膜制備而成的生物炭包膜肥應運而生。生物炭包膜肥施入土壤后可以使肥料養分緩慢釋放，具有改善土壤理化性質[22]，提高作物養分利用率[23]和減少土壤氮磷流失[24]的作用，已引起了科學界的關注。但是，目前有關生物炭和生物炭包膜肥輸入對毛竹林土壤phoD功能菌和磷循環功能基因的研究還鮮有報道。

因此，本研究通過野外林地實驗，研究竹炭和竹炭包膜復合肥施用對土壤磷素有效性的影響。在此基礎上，通過Miseq和宏基因組測序技術，研究其施用對毛竹林土壤phoD功能菌群落結構和磷循環功能基因相對豐度的影響，從而為竹炭和竹炭包膜復合肥在林業中的大規模應用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗點概況

試驗點位于浙江省杭州市(30°14'N、119°42'E)，屬亞熱帶季風氣候，四季分明，年平均氣溫16.4℃，降雨量1629 mm，全年日照時數1847 h。土壤類型為紅黃壤，基本理化性質如下：容重1.18 g/cm3、pH 5.03 (土水比 1∶5)、有機碳 20.13 g/kg、總氮 1.61 g/kg、總磷 0.51 g/kg、有效磷 5.87 mg/kg。

1.2 試驗設計

本試驗設3個處理，分別為單施復合肥(CK)、竹炭包膜復合肥(BF)和復合肥+竹炭(SC)。每個處理3次重復，共計9個小區。每個小區面積為100 m2(10 m×10 m)。竹炭、復合肥和竹炭包膜復合肥均勻撒入各試驗小區，翻入0—20 cm土壤中。供試復合肥 (15–15–15)施用量為 300 kg/hm2，竹炭包膜復合肥 (9–9–9)添加量為 490 kg/hm2，CK 和 BF 兩個處理施磷量基本一致。竹炭包膜復合肥的包膜材料由竹炭、腐殖質、膨潤土和改性淀粉制成，膜材料中竹炭的添加量為25%，肥芯為復合肥。SC處理竹炭添加量為5 t/hm2。在施肥后的第30和100天，測定土壤pH、容重、總碳、總氮、總磷和有效磷含量。在施肥后100天，采集土壤使用Miseq擴增子測序技術測定毛竹林土壤中phoD功能菌的群落結構。在此基礎上，采用宏基因組技術測定土壤磷循環功能基因的相對豐度。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤理化性質測定 土壤pH采用玻璃電極法測定，土水比為1：5。

土壤研磨過0.15 mm篩，土壤全氮、全碳含量使用元素分析儀 (Flash EA1112, Thermo Finnigan,Italy)測定，全磷采用氫氧化鈉熔融—鉬銻抗比色法測定[25]，有效磷采用鹽酸–氟化銨提取—鉬銻抗比色法測定。

1.3.2 土壤DNA提取和高通量測序 土壤總DNA 使用 Fast DNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals,USA)試劑盒提取。采用添加了不同標簽(barcode)的phoD基因特異性引物ALPS-F730(5′–CAGTGGG ACGACCACGAGGT–3′)和 ALPS-1101(5′–GAGGC CGATCGGCATGTCG–3′)[26–28]進行 PCR 擴增，純化產物使用Illumina MiSeq-PE250平臺進行測序分析。同時，對獲取的DNA樣品直接使用Illumina NovaSeq高通量測序平臺進行宏基因組測序。

1.3.3 數據處理和分析 使用QIIME 2軟件，調用USEARCH工具，對phoD基因的原始測序數據，進行質控、去噪、拼接和去嵌合體。在97%的序列相似度水平聚類，得到操作分類單元(OTU)，將OTU代表序列在NCBI數據庫中進行比對注釋，得到OTU的分類學信息。對于宏基因組的數據，首先對質控后的序列采用Megahit軟件進行拼接，對不小于200 bp的Contigs序列，采用MetaGeneMark軟件進行基因預測，并獲得對應的蛋白序列。然后，使用Diamond軟件將獲得的蛋白序列集與KEGG數據庫比對并獲得功能基因注釋信息，閥值設置為0.00001。最后，參照Dai等[8]和Liu等[29]方法篩選出與磷循環相關的功能基因，并使用Salmon軟件計算各功能基因的相對豐度。phoD功能基因擴增子和宏基因組原始測序數據已上傳至NCBI數據庫，生物項目編號分別為PRJNA746410和PRJNA775002。

1.4 統計分析

使用SPSS 20.0軟件對竹炭和竹炭包膜復合肥添加對毛竹林土壤理化性質的影響進行LSD單因素方差分析(α=0.05)。以phoD功能菌抽平后的OTU數據，使用R軟件中Stats包計算Bray-Curtis距離矩陣，并進行層次聚類分析。使用R軟件繪制毛竹林土壤phoD功能菌屬水平和磷循環功能基因的相對豐度水平。利用Heatmap的顏色梯度來反映其微生物和功能基因的豐度差異，綠色越深代表豐度越大，咖啡色越深代表豐度越小。采用Canoco 5.0軟件，將土壤phoD功能菌相對豐度作為響應變量，土壤理化性質作為環境因子進行冗余分析，并繪制相應的分析圖。

2 結果與分析

2.1 竹炭和竹炭包膜復合肥添加對毛竹林土壤理化性質的影響

由表1可知，在施肥后的第30和100天，與CK相比，SC處理顯著增加了毛竹林土壤的pH、總碳和有效磷的含量，降低了土壤的容重。SC處理雖然一定程度上增加了土壤總氮和總磷的含量，但是均沒有達到顯著性差異水平(P>0.05)。與CK相比，竹炭包膜復合肥的添加對土壤pH、容重、總碳、總氮、總磷和有效磷含量均沒有顯著的影響(P>0.05)。

表1 竹炭和竹炭包膜復合肥添加后第30和100天毛竹林土壤的理化性質Table 1 Soil properties as affected by biochar and biochar-coated slow-release fertilizer at 30 and 100 days after application

2.2 竹炭和竹炭包膜復合肥施用對phoD功能菌多樣性和組成的影響

采用Miseq測序技術對毛竹林土壤phoD功能菌進行測序分析，不同樣品獲得有效序列47350～93883條，分布于4個門7個綱，覆蓋度>99% (表2)，樣品測序深度滿足要求。從Venn圖(圖1)可知不同處理共有phoD功能菌OTU數目為1312個，其中CK處理的獨有OTU數目最多(491個)，而BF處理的獨有OTU數目最少(446個) 。在此基礎上，對毛竹林土壤phoD功能菌進行alpha多樣性分析，分析發現BF和SC處理對phoD功能菌Chao1、Simpson和Shannon指數均沒有顯著性的影響(P>0.05)。

表2 不同處理土壤phoD功能菌多樣性指數Table 2 The diversity indices ofphoD functional bacteria in soil under different treatments

圖1 不同處理毛竹林土壤phoD功能菌共有和獨有OTU數目Fig. 1 Shared and unique OTU numbers ofphoD functional bacteria in Moso bamboo forest soil under different treatments

由圖2可知，毛竹林土壤中phoD功能菌優勢菌科為 Bradyrhizobiaceae (慢生根瘤菌科)、Bukholderiaceae (伯克氏菌科)、Labilitrichaceae、Hyphomicrobiaceae (生絲微菌科)和 Oxalobacteraceae (草酸桿菌科) (圖2)。此外，相對豐度較低的科為Phyllobacteriaceae (葉桿菌科)、Halomonadaceae (鹽單胞菌科)、Methylobacteriaceae (甲基桿菌科)和 Rhizobiaceae (根瘤菌科)等。與CK相比，SC處理顯著增加了毛竹林土壤Bradyrhizobiaceae，顯著降低Bukholderiaceae的相對豐度(P<0.05)。BF處理則顯著增加了Labilitrichaceae和Hyphomicrobiaceae的相對豐度(P<0.05)。層次聚類分析則表明，SC或BF處理可以改變土壤的phoD功能菌群落結構組成。

圖2 phoD功能菌層次聚類分析Fig. 2 Hierarchical cluster analysis ofphoD functional microorganisms

進一步分析表明，毛竹林土壤共測得23個屬，百分含量較高的為α-變形菌綱中的Bradyrhizobium(慢生根瘤菌屬)、Mesorhizobium(中慢生根瘤菌屬)、Pseudolabrys(假雙頭斧形菌屬)、Sinorhizobium(中華根瘤菌屬)、Rhodoplanes(紅游動菌屬)、Methylobacterium(甲基桿菌屬)，β-變形菌綱中的Ralstonia(羅爾斯頓菌屬)，δ-變形菌綱中的Labilithrix，以及放線菌綱中的Streptomyces(鏈霉菌屬)、Micromonospora(小單孢菌屬)和Saccharopolyspora(糖多孢菌屬)。其中，Bradyrhizobium、Mesorhizobium、Labilithrix和Sinorhizobium是毛竹林土壤中主要的phoD功能菌屬，占了7.5%以上的注釋微生物。由圖3可知，BF處理明顯增加了Micromonospora、Methylobacterium和Streptomyces的相對豐度，降低了Rhodoplanes的相對豐度，對Bradyrhizobium和Labilithrix影響不明顯。SC處理則增加了Bradyrhizobium屬的微生物。但是，與對照相比，SC處理降低了Mesorhizobium的相對豐度，對Sinorhizobium的影響不明顯。

圖3 不同處理下毛竹林土壤phoD功能菌屬水平的相對豐度Fig. 3 The relative abundance ofphoD functional microorganisms at genus level in Moso bamboo forest field as affected by different treatments

在此基礎上，將土壤phoD功能菌相對豐度作為響應變量，土壤理化性質作為環境因子進行RDA分析。結果表明，各處理均有較好的聚類表現(圖4)。pH對phoD功能菌的相對豐度的解釋度最高為43.7% (P=0.026)。其次分別為總氮(9.7%)和總磷(8.4%)，但是均沒有達到顯著性的水平。其中，第一標準軸(RDA1)和第二標準軸(RDA2)分別解釋了土壤phoD功能菌相對豐度變化的71.8%和15.8%。

圖4 不同環境參數與毛竹林土壤phoD功能菌RDA分析Fig. 4 RDA analysis of different environmental parameters and soilphoD functional microorganisms in Moso bamboo forest soil

2.3 竹炭和竹炭包膜復合肥施用對磷循環功能基因的影響

通過宏基因組測序共獲得15.1億條Reads，平均每個樣品1.67億條。經序列組裝后，每個樣品的平均Contigs數為453.7萬條。其中，涉及到磷循環功能基因占總Contigs數的0.57%～0.70%，包含了編碼無機/有機磷酸鹽特異轉運酶的基因，三磷酸甘油脫氫酶的基因，C-P鍵裂解酶基因，以及堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的功能基因等。由圖5可知，與對照CK相比，SC處理顯著增加了毛竹林土壤三磷酸甘油脫氫酶單元(ugpAEC)、C-P鍵裂解酶(phnGHIJL)、有機磷酸鹽特異轉運蛋白(phnCD)、無機磷酸鹽特異轉運蛋白(pstCAB)和堿性磷酸酶(phoA和phoD)基因的相對豐度(P<0.05)。但是，BF處理僅顯著增加了ugpE、pstA和phoD基因的相對豐度。SC處理對土壤酸性磷酸酶基因具有不確定性。與對照CK相比，酸性磷酸酶基因(phoN)在SC中得到了富集 (P<0.05)，但是酸性磷酸酶基因(aphA和alpA)在SC中顯著下降。此外，與對照CK相比，SC處理增加了磷酸轉運系統調控蛋白(phoU)、組氨酸蛋白激酶(phoR)和磷酸鹽調控反應因子基因(phoB)的相對豐度，但是沒有顯著性的影響(P>0.05)。

圖5 毛竹林土壤磷循環功能基因的相對豐度熱圖Fig. 5 The heatmap of the relative abundance of phosphorus cycling genes in Moso bamboo forest soil

3 討論

3.1 竹炭和竹炭包膜復合肥施用對土壤理化性質的影響

生物炭作為一種高效的土壤改良劑，施入土壤后會顯著改變土壤的理化性質[30–31]。本研究發現，竹炭的輸入顯著增加了毛竹林土壤的pH、總碳和有效磷的含量。該研究結果與王典等[32]和陳心想等[33]研究結果基本一致，即施用生物炭還有助于提高土壤pH和有效磷的含量。生物炭表面含有豐富的堿性基團，內部含有豐富的礦質元素形成的碳酸鹽，其在土壤老化過程中會逐步釋放堿性物質[34–35]，增加土壤的pH。施用竹炭增加土壤有效磷的含量可能主要有以下3方面的原因：1)竹炭自身攜帶的磷素可以直接提高土壤有效磷的含量[36]；2)土壤中Al3+、Ca2+、Mg2+和Fe3+等離子可能被竹炭表面官能團吸附，從而減少了礦物離子對磷的吸附固定[37]。3)竹炭的輸入可以通過影響土壤磷循環功能基因的豐度來促進土壤有效磷含量的增加[38]。此外，竹炭的輸入降低了土壤容重，這主要是由于竹炭的密度較小，孔隙較多。然而，與對照相比，竹炭包膜復合肥的輸入對毛竹林土壤各理化性質均沒有產生顯著的影響。這可能是因為該包膜肥中竹炭的添加量較少。當然，竹炭包膜復合肥添加對毛竹林土壤理化性質的影響還需要進一步研究。

3.2 竹炭和竹炭包膜復合肥施用對毛竹林土壤phoD功能菌的影響

由圖2和圖3可看出，Proteobacteria (變形桿菌門)中根瘤菌包括Bradyrhizobium(慢生根瘤菌屬)、Mesorhizobium(中慢生根瘤菌屬)和Sinorhizobium(中華根瘤菌屬)是毛竹林土壤中最為重要的phoD功能菌。Ragot等[39]測定了澳大利亞和瑞士6種不同氣候條件下的土壤性質，發現Rhizobiales是土壤phoD功能菌的優勢菌目，占18%～27%。這一方面可能與固氮菌具有較強的解磷能力[40]，毛竹林等低磷土壤中有利于其生長；另一方面固氮微生物具有較強的耐酸性[41–42]，有利于其在南方酸性的毛竹林土壤中生長。Luo等[28]研究也發現，長期施肥的稻田中最重要的phoD功能菌為Micromonospora、Streptomyces(鏈酶菌屬)、Bradyrhizobium、Burkholderia和Lysobacter。其中，Bradyrhizobium占了phoD功能菌的50%以上。有研究也發現，phoD功能菌在提高土壤有效磷的同時，也有助于土壤根瘤菌的生長[43]。

此外，土壤環境條件的改變也可能會影響phoD功能菌的群落結構。Wang等[44]通過對不同土壤中生長的小麥根際微生物的研究發現，土壤pH是phoD功能菌群落的重要驅動因素。本研究RDA分析結果也揭示了環境參數pH與土壤phoD功能菌之間具有顯著的相關性(P<0.05)。方差分析表明，pH解釋了43.7%的群落變異度。如圖4所示，pH值與土壤Bradyrhizobium和Labilithrix具有正相關關系，與Ralstonia、Mesorhizobium和Saccharopolyspora具有負相關關系。該研究結果與Luo等[28]和Ragot等[39]的研究一致，即土壤pH驅動著土壤phoD功能菌群落。但是，總磷與土壤phoD功能菌相關性不明顯，僅解釋了8.4%的群落變異度。這可能與毛竹林的磷素大部分為難溶性的無效磷，難以被微生物利用有關。Jorquera等[45]觀察到，在智利Andisol牧場，單獨施用磷肥不會影響phoD功能菌群落結構，而氮磷聯合施用才會改變phoD功能菌群落結構。本研究中，竹炭或者竹炭包膜復合肥的添加也確實沒有顯著影響土壤總氮含量(P>0.05) (表1)。此外，與CK相比，Micromonospora、Methylobacterium和Streptomyces在BF處理中具有較高的相對豐度。相關機理有待進一步研究。

3.3 竹炭和竹炭包膜復合肥添加對磷循環功能基因的影響

微生物介導的磷素轉化過程主要包含三類微生物基因群，即無機磷溶解和有機磷礦化基因，磷的吸收和轉運基因，以及磷饑餓反應調節基因。在土壤中，尤其在磷素缺乏的土壤中，無機磷素轉運基因(pstSCAB)非常重要，因為它們允許微生物和植物的競爭中奪取生物有效磷[46–47]。Bergkemper等[48]研究發現缺磷的森林土壤中pstSCAB基因具有較高的豐度。本項目研究中也發現，與CK相比，添加竹炭的處理有助于增加無機磷轉運基因(pstCAB)的相對豐度。這可能是由于竹炭的添加增加毛竹林根系的生物量，增強根系與微生物對無機磷的競爭，從而提高了毛竹林土壤中無機磷素轉運基因(pstCAB)的相對豐度[8]。竹炭的添加也有助于增加毛竹林土壤中phoU、phoR和phoB基因的豐度。這些功能基因參與了P-饑餓反應調節，并且與無機磷轉運基因(pst)密切相關[14]。現有的研究已經表明，phoR和phoB雙組分系統有效調控無機磷轉運基因(pstSCAB)的表達，使其在低磷條件下有效利用磷源[49]。此外，竹炭也可調控毛竹林土壤有機磷的礦化和轉運。無論是土壤三磷酸甘油脫氫酶單元(ugpAEC)，C-P鍵裂解酶基因(phnGHIJL)，還是有機磷酸鹽特異轉運蛋白(phnCDE)在SC處理中均有較高的相對豐度。這可能與竹炭的添加提高了土壤的pH有關。Dai等[8]的研究也發現，土壤pH與磷素的溶解、礦化、吸收和轉運等基因具有顯著的正相關關系。長期施用氮肥降低了土壤pH，影響了土壤磷酸單酯和磷酸二酯的潛在礦化作用。這可能是竹炭包膜復合肥添加對土壤磷循環功能基因的影響不明顯的原因。進一步分析還發現，同時添加復合肥和竹炭提高了土壤堿性磷酸酶(phoA和phoD)基因的相對豐度。這一方面是由于竹炭含有較高的C和N，其輸入提高了土壤的C/P和N/P化學計量比，增加了土壤微生物對土壤無機磷的需求；另一方面，竹炭可以促進土壤微生物的生長，從而提高了土壤堿性磷酸酶基因的豐度。

4 結論

同時施用竹炭和復合肥可顯著增加毛竹林pH、總碳和有效磷含量，降低了土壤的容重。但是，將竹炭作為包膜材料制備成竹炭包膜復合肥施入土壤后，其有益效果不再顯著。pH是毛竹林土壤phoD功能菌的重要驅動因素。因此，施用竹炭改變了土壤中phoD功能菌的群落結構，提高了參與毛竹林土壤磷素溶解、礦化、吸收和轉運功能基因的相對豐度。從土壤磷的有效性及相關微生物基因的表達角度，竹炭不宜作為包膜材料施用。