氣管鏡下宏基因組學(xué)二代測(cè)序技術(shù)在肺癌鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值

米 婷，王雅寧

(1.西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 寶雞 721000； 2.寶雞市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 寶雞721004)

肺癌 (Lung cancer,LC)，作為一種醫(yī)學(xué)上嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，其具有較高的發(fā)病率及病死率。由于其起源于肺部支氣管黏膜，也被稱為原發(fā)性支氣管肺癌 (Primary bronchogenic carcinoma,PBC)。有研究顯示，女性肺癌的發(fā)病率已超過(guò)乳腺癌發(fā)病率，占據(jù)惡性腫瘤發(fā)病率的第二位，僅次于男性肺癌的發(fā)病率[1-3]。肺癌患者早起發(fā)病時(shí)臨床癥狀并不明顯，這就導(dǎo)致患者確診時(shí)大都處于晚期狀態(tài)，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)間。不可否認(rèn)，近段時(shí)間以來(lái)，許多研究者進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究并發(fā)現(xiàn)了不少新的診斷方法和治療手段，但是肺癌的治療效果并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的效果，其近五年來(lái)生存率約17%，這說(shuō)明我國(guó)治療肺癌的水平仍處于較低水平[4-8]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，氣管鏡由于操作方便在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其是在肺部疾病的治療中，同時(shí)也進(jìn)一步提高了肺部疾病的診斷率[9-10]。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，肺癌的發(fā)生不僅是由環(huán)境外因?qū)е碌模z傳、機(jī)體炎癥以及體內(nèi)微生物菌群等人體內(nèi)因一定程度上也對(duì)其發(fā)生起著作用[11-12]，某些特定的細(xì)菌與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。人體微生物菌群作為一個(gè)龐大的基因組，其能夠達(dá)到人體自身基因組的100倍，能夠維持人體內(nèi)環(huán)境平衡，從而保證生命安全[13-15]。隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，宏基因組學(xué)檢測(cè)在基因組學(xué)檢測(cè)中發(fā)揮的作用越來(lái)越大，也向我們展現(xiàn)了菌群的基因多樣性，越來(lái)越多的人嘗試采用宏基因組學(xué)去探究人體菌群與各類(lèi)疾病之間的相關(guān)性。近幾年來(lái)，大量研究表明，人類(lèi)的飲食習(xí)慣以及生活習(xí)慣(吸煙、飲酒)很大程度影響著自身的菌群結(jié)構(gòu)，而這些習(xí)慣往往容易致癌，因此，我們有理由相信菌群與癌癥發(fā)展之間存在一定的聯(lián)系。本研究通過(guò)運(yùn)用支氣管鏡活檢探究宏基因組學(xué)二代測(cè)序技術(shù)診斷肺腺癌的臨床應(yīng)用價(jià)值，旨在為肺癌的診斷方法提供新的可能，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019年9月至2020年2月西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院診治的進(jìn)行支氣管鏡檢查的患者中選擇32例肺癌患者(M組)，20例肺部非肺癌肺部疾病患者(MN組)和18例健康人群作為對(duì)照組(N組)。M組患者男17例，女15例，年齡42～58歲，平均(49.67±5.98)歲；MN組患者男11例，女10例，年齡44～60歲，平均(47.58±6.14)；N組患者男10例，女8例，年齡40～57歲，平均(48.39±5.62)歲。收集所有受試者的病史，并于術(shù)前對(duì)患者進(jìn)行心電圖檢查、各項(xiàng)肺功能檢查、血常規(guī)和凝血功能檢查以及相關(guān)影像學(xué)檢查。三組患者年齡、性別等一般資料比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，具有可比性。①健康對(duì)照組病例納入標(biāo)準(zhǔn)：身體狀況良好；無(wú)其他惡性腫瘤、腦部疾病及心臟疾病患者；無(wú)肺部相關(guān)手術(shù)史患者；沒(méi)有哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 或其他慢性氣道疾病病史和非病理性呼吸道表現(xiàn)；患者在支氣管鏡檢查前沒(méi)有接受過(guò)化療、放療、手術(shù)或其他肺癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)疾病患者；檢查前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素患者；行胸片檢查有疑似肺部病變；不適合進(jìn)行支氣管檢查患者。②非肺癌肺部疾病組病例納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)其他惡性腫瘤、腦部疾病及心臟疾病患者；無(wú)肺部相關(guān)手術(shù)史患者；患者存在肺癌之外的肺部疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)病理學(xué)檢查疑似存在肺癌；檢查前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素患者。③肺癌患者研究組病例納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為肺腺癌患者；無(wú)其他惡性腫瘤、腦部疾病及心臟疾病患者；無(wú)肺部相關(guān)手術(shù)史患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為非腫瘤；術(shù)前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素患者。本研究已經(jīng)由西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均了解此次研究情況，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 咽拭子采樣方法：患者取坐位，取滅菌棉拭子越過(guò)舌根緩慢伸入咽后壁以及扁桃體側(cè)壁，旋轉(zhuǎn)擦拭一周，收集黏膜細(xì)胞，取出棉拭子時(shí)避免碰觸舌頭、懸垂體、口腔黏膜以及唾液。將棉拭子頭部放入滅菌凍存管中，與-80 ℃進(jìn)行保存。檢測(cè)之前為了增加微生物的附著率，需使用無(wú)菌生理鹽水浸濕棉拭子。

1.2.2 肺泡灌洗液收集方法：研究對(duì)象在進(jìn)行支氣管鏡檢查之前，為確保患者安全，需采用霧化劑進(jìn)行局部麻醉處理，之后使用咪達(dá)唑侖與芬太尼進(jìn)行鎮(zhèn)靜處理。將支氣管鏡從鼻腔插入，經(jīng)咽喉到達(dá)氣管和支氣管。在支氣管鏡達(dá)到舌葉或中葉開(kāi)口處時(shí)，注射適當(dāng)?shù)睦嗫ㄒ蜻M(jìn)行麻醉，緊接著將60 ml 0.9%的氯化鈉溶液注入管腔進(jìn)行灌注，回收率≥30%時(shí)認(rèn)定為樣本合格，收集得到的肺泡灌洗液進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 DNA 提取及測(cè)序：使用珠打法從氣道樣品中分離細(xì)菌 DNA。使用巢式 PCR 對(duì)細(xì)菌16S rRNA的 V3-V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。使用 Miseq 平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。使用 USEARCH 8.0 從原始數(shù)據(jù)中提取干凈的數(shù)據(jù)。 使用 UPARSE 去除嵌合序列后，基于 97% 的相似性對(duì)操作分類(lèi)單元(Operational taxonomic units，OTU)進(jìn)行分類(lèi)。通過(guò) RDP 分類(lèi)器針對(duì) Silva (SSU 123) 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)在使用 70% 的置信閾值的基礎(chǔ)下對(duì)每個(gè) 16s rRNA 基因序列的系統(tǒng)衍生的從屬關(guān)系進(jìn)行分析。

1.2.4 觀察以及評(píng)價(jià)指標(biāo)：①采用shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)來(lái)比較不同組別研究對(duì)象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群組間分類(lèi)的多樣性的差異；②比較三組對(duì)象在菌門(mén)分類(lèi)等級(jí)上的物種豐度差異；③采用準(zhǔn)確率和精度作為評(píng)價(jià)性指標(biāo)來(lái)衡量肺泡灌洗液中不同菌屬對(duì)鑒別肺癌的診斷價(jià)值的真實(shí)性。

2 結(jié) 果

2.1 三組研究對(duì)象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群多樣性比較 對(duì)于咽部微量菌群而言，N組與MN組患者Shannon、Simpson指數(shù)分別比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，與M組患者Shannon、Simpson指數(shù)分別比較均有明顯降低(均P<0.05)；對(duì)于肺泡灌洗液微量菌群而言，M組與MN組患者Shannon、Simpson指數(shù)分別比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，與N組患者Shannon、Simpson指數(shù)分別比較均有明顯升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組研究對(duì)象咽部以及肺泡灌洗液微量菌群多樣性比較

2.2 三組研究對(duì)象在門(mén)分類(lèi)等級(jí)上物種豐度差異比較 對(duì)于咽部微量菌群而言，常見(jiàn)的菌門(mén)分別為擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)與梭桿菌門(mén)，其中厚壁菌門(mén)以及梭桿菌門(mén)在物種豐度上比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，M組與MN組患者厚壁菌門(mén)與梭桿菌門(mén)豐度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，N組患者厚壁菌門(mén)豐度明顯較低(P<0.05)，梭桿菌門(mén)豐度明顯較高(P<0.05)。見(jiàn)表2。對(duì)于肺泡灌洗液微量菌群而言，常見(jiàn)的菌門(mén)分別為擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、放線菌門(mén)與螺桿菌門(mén)，其中厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)以及放線菌門(mén)在物種豐度上比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，M組與MN組患者厚壁菌門(mén)與梭桿菌門(mén)豐度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，N組患者厚壁菌門(mén)豐度明顯較低(P<0.05)，梭桿菌門(mén)豐度明顯較高(P<0.05)；M組與N組患者放線菌門(mén)豐度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，MN組患者放線菌門(mén)豐度明顯較高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 三組研究對(duì)象咽部微量菌群在菌門(mén)分類(lèi)等級(jí)上物種豐度差異比較(%)

表3 三組對(duì)象肺泡灌洗液微量菌群在菌門(mén)分類(lèi)等級(jí)上物種豐度差異比較(%)

2.3 肺泡灌洗液中不同菌屬對(duì)鑒別肺癌診斷價(jià)值 運(yùn)用準(zhǔn)確度和精度評(píng)價(jià)診斷由宏基因組學(xué)二代測(cè)序技術(shù)預(yù)測(cè)出的鑒別肺癌價(jià)值較高的三個(gè)菌屬葡萄球菌屬、鏈球菌屬和硒單胞菌屬，見(jiàn)圖1、2。

圖1 葡萄球菌屬、鏈球菌屬和硒單胞菌屬診斷肺癌準(zhǔn)確度

圖2 葡萄球菌屬、鏈球菌屬和硒單胞菌屬診斷肺癌精度

3 討 論

在我們的研究中，我們對(duì)肺癌患者的咽部以及肺泡灌洗液進(jìn)行了采樣，并將它們與來(lái)自配對(duì)的非癌側(cè)的樣本以及來(lái)自“健康”對(duì)照的樣本進(jìn)行了比較。 我們的分析表明，肺癌患者體內(nèi)的微生物群落與“健康”對(duì)照組的微生物群落是有區(qū)別的，肺癌患者肺微生物群組成的改變不僅限于癌組織。據(jù)我們所知，我們第一次記錄了鏈球菌屬在肺癌患者中的含量豐富，并表現(xiàn)出中等分類(lèi)潛力。此外，其他重要發(fā)現(xiàn)包括鏈球菌屬在肺癌患者中較高，而葡萄球菌在“健康”對(duì)照中更高。還觀察到樣本中氣道微生物群譜從“健康”對(duì)照到非癌區(qū)域到配對(duì)癌區(qū)域的逐漸“轉(zhuǎn)變”。這些數(shù)據(jù)為了解下呼吸道微生物與肺癌的關(guān)系提供了初步見(jiàn)解，并強(qiáng)調(diào)了呼吸道失調(diào)與肺癌之間的相互影響。到目前為止，三項(xiàng)使用下一代測(cè)序的研究表征了肺癌患者的肺微生物組。在對(duì)中國(guó) 8 例從不吸煙女性肺癌病例和 8例從不吸煙女性對(duì)照的痰液取樣進(jìn)行的小規(guī)模研究中，在肺癌病例中觀察到鏈球菌屬、鏈球菌屬水平顯著富集[16-18]。在我們的研究中，病例組中鏈球菌屬始終豐富，與我們的發(fā)現(xiàn)一致。 然而，后一組中兩組在多樣性上沒(méi)有差異。異質(zhì)性可能與地域和種族差異、方法學(xué)差異以及樣本類(lèi)型的代表性或分組設(shè)計(jì)的合理性有關(guān)。 最近，對(duì)肺微生物組進(jìn)行了迄今為止規(guī)模最大的研究，其中包括微生物分析中的 165 個(gè)非惡性和 31 個(gè)配對(duì)腫瘤樣本[19]。配對(duì)腫瘤的多樣性降低也與我們的結(jié)果一致。我們的研究為表征肺癌患者非惡性肺組織的肺微生物組提供了有力的依據(jù)。 然而，非惡性組織和配對(duì)腫瘤樣本的比較僅限于肺癌患者的細(xì)菌多樣性分析，我們的研究缺乏與健康對(duì)照受試者的肺微生物組的比較，這限制了定義肺微生物作用的能力。在我們的研究中，與來(lái)自對(duì)照組的樣本相比，來(lái)自癌變部位的下呼吸道樣本具有顯著較低的群落多樣性。 這一發(fā)現(xiàn)與前兩項(xiàng)使用痰和肺組織樣本對(duì)肺癌微生物群落進(jìn)行的研究相一致。細(xì)菌多樣性的一致差異表明，在某些疾病條件下，氣道微生物群可能在數(shù)量和質(zhì)量方面發(fā)生變化[20]。 這些發(fā)現(xiàn)可以結(jié)合到“癌癥衛(wèi)生假說(shuō)”中，以假設(shè)癌癥發(fā)病率的增加可能與衛(wèi)生條件的增加/特定微生物接觸的減少有關(guān)，類(lèi)似于已知的自身免疫性疾病和過(guò)敏癥[21]。 然而，我們不能完全排除替代假設(shè)，即觀察到的多樣性變化可能只是腫瘤進(jìn)展的被動(dòng)副產(chǎn)品。

本研究探索氣管鏡下宏基因組學(xué)二代測(cè)序技術(shù)在鑒別診斷肺癌的臨床應(yīng)用價(jià)值。采用宏基因組學(xué)二代測(cè)序技術(shù)分析三組研究對(duì)象咽部的菌群特征，對(duì)三組研究對(duì)象上呼吸道菌群與下呼吸道菌群的差異進(jìn)行了比較分析；同時(shí)通過(guò)對(duì)肺癌患者進(jìn)行代謝組學(xué)分析，找出了臨床上肺癌患者確診的潛在標(biāo)志物。結(jié)果顯示，宏基因組學(xué)二代測(cè)序技術(shù)用來(lái)預(yù)測(cè)診斷肺癌是有一定運(yùn)用價(jià)值的。葡萄球菌屬、鏈球菌屬和硒單胞菌屬可作為肺癌診斷的潛在標(biāo)志物。本文的不足之處在于研究對(duì)象數(shù)目較少，結(jié)果偏單一，使結(jié)果容易產(chǎn)生誤差，以后的研究擴(kuò)大研究范圍是有必要的。