非小細胞肺癌中CDKN2A 蛋白表達及其與臨床分期及預后的關系

李俊彥 招軒娜

（廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524001）

非小細胞肺癌是一種惡性腫瘤，發病率約占肺癌的80%。肺癌患者通常預后不良，在早期時易出現遠處轉移，但目前關于肺癌的發病機制尚不十分明確。本研究旨在探討非小細胞肺癌中CDKN2A蛋白表達及其與臨床分期及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2019年10 月至2020年10月我院收治并手術治療的非小細胞肺癌患者80例作為研究對象，其中男性48例，女性32例；年齡33～75（60.82±11.23）歲；腺癌 45例，鱗癌 35例。

1.2 方法：采用Western-blot 法測定非小細胞肺癌組織及非腫瘤組織中CDKN2A 的表達，提取標本中的總RNA，采用RT-PCR 試劑盒擴增，總反應體系為 25μL，包括 4μL RNA 模板，上游引物 2μL，下游引物 2μL，2×Tap PCR Master Mix12μL，剩余為雙蒸水。95 ℃預處理5 min 后進入循環反應，熱變性溫度為95℃，時間為30s；延伸溫度為72℃，時間為30s；退火時間為 30s；退火溫度為 60℃、61℃、59℃，均為30個循環；最后進行延伸，時間為10 min。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴增產物進行檢測。采用常規蛋白提取法提取腫瘤組織和非腫瘤喉組織中的總蛋白，行電泳分離，利用硝酸纖維素膜進行轉膜，采用濃度為5%的脫脂奶粉并加1 倍磷酸鹽緩沖液進行封閉，置于4℃下保存。取出后與CDKN2A 進行反應，以 1∶1000 的比例進行稀釋，室溫下放置1 h，第二抗體用辣根過氧化物酶偶聯羊抗兔抗體，以1∶1000 的比例進行稀釋，溫下放置1h，采用 DAB 顯色試劑 1∶100 比例稀釋后顯色，使用凝膠圖像處理系統分析目標帶密度值。評分標準：0 分：陽性細胞比例低于5%；1 分：陽性細胞比例為5%～25%；2 分：陽性細胞比例為26%～50%；3分：陽性細胞比例為51%～75%；4 分：陽性細胞比例超過75%。染色強度：0 分：無著色，1 分：黃色，2分：棕黃色，3 分：棕褐色；最終評分為兩項得分的乘積：陰性組：得分低于3 分，陽性組：得分≥3 分，其中低表達：得分低于5 分，高表達：得分≥5 分。

1.3 統計學分析：運用SPSS20.0 軟件行數據分析，計量資料以[n（%）]形式顯示，采用 χ2檢驗；計數以（）形式顯示，采用 t 檢驗；P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDKN2A 蛋白水平的表達與臨床分期的關系：CDKN2A 表達產物位于細胞胞漿中，呈為棕黃色染色顆粒。CDKN2A 蛋白在非小細胞肺癌腫瘤組織中的高表達率為58.75%，在癌旁組織中的高表達率為23.75%，非小細胞肺癌腫瘤組織中的CDKN2A 蛋白表達高于癌旁組織（χ2=20.220，P=0.000）。非小細胞肺癌腫瘤組織中的CDKN2A 蛋白水平的表達與臨床分期的有關（P<0.05），詳見表1。

表1 CDKN2A 蛋白與臨床分期的關系

2.2 CDKN2A 蛋白與預后的關系：CDKN2A 蛋白高表達非小細胞肺癌患者總生存期低于低表達組，差異有統計學意義（HR=1.31，P=0.01）；CDKN2A 高低表達組間非小細胞肺癌患者無疾病進展生存差異無統計學意義（HR=0.93，P=0.58）。

3 討論

肺癌是一種高發的呼吸系統惡性腫瘤。非小細胞肺癌的惡性程度較高，切治療難度較大，故及早發現對預防非小細胞肺癌轉移具有十分重要的意義。因此，參與細胞周期調控、基因改變等成為臨床研究熱點。CDKN2A 直接參與了細胞周期調控，是一種新型的抗癌基因，被稱為細胞周期中的剎車裝置，若發現其失靈后則會使細胞發生惡性增殖，進而形成惡性腫瘤[3]。研究發現，CNKN2A 在多種腫瘤組織中均呈現出差異表達，且呈現表達上調，與患者的病理特征與預后具有相關性[4]。然而，CDKN2A在非小細胞肺癌中表達的研究報道較少，CD KN2A高低表達與非小細胞肺癌患者的預后情況也尚不明確[5]。CDKN2A 基因在細胞周期調控中具有較明顯的腫瘤抑制作用，CDKN2A 在許多腫瘤中均出現丟失和突變。探討CDKN2A 在非小細胞肺癌組織中的差異表達，可能發現其與細胞生物學功能及患者預后的關系。

賀小威等的研究結果曾報道[6]，非小細胞肺癌組織中CDKN2A 蛋白的表達顯著高于癌旁組織，CDKN2A 蛋白表達水平與患者的OS 有關。本研究結果顯示，本研究結果與賀小威等[6]的數據基本一致。結果說明CDKN2A 蛋白在非小細胞肺癌組織中表達上調，CDKN2A 蛋白的高表達與患者的臨床分期和預后較差有關。

綜上所述，CDKN2A 蛋白在非小細胞肺癌腫瘤組織中表達上調，其表達水平與患者的臨床分期和生存期有關，CDKN2A 可作為非小細胞肺癌患者臨床分期及預后預測的標志物。但本研究僅從生物信息的層面進行了證實，后期仍需進行相關分子生物學實驗驗證。