去細胞異種神經支架對大鼠足底創面觸覺功能重建的影響及機制研究

樊 力，馮 亮

(陜西省核工業二一五醫院手足外科，陜西 咸陽 712000)

足底是機體重要的組織器官之一，包括足跟、足外側部分、跖趾關節，具有吸收震蕩、負重、行走等多種功能[1]。足底損傷形成創面是臨床外科的常見病和多發病，伴功能障礙、疼痛、感染等多種并發癥，也嚴重影響機體的身心健康。足底創面修復除了要注重耐磨、耐壓外，尤其需要重視足底的觸覺功能恢復，為此在修復選擇中要合理選擇恢復感覺功能的方法，防止足底及足后跟功能障礙[2-3]。當前臨床上多采用皮瓣移植、電磁療法、高壓氧等多種治療手段促進足底創面修復，但是很多機體在創面修復區往往出現觸覺功能的喪失，從而導致創面修復失敗。隨著醫學技術的發展，組織再生技術得到了廣泛應用，其能促進創面修復、再生和功能恢復[4]。其中觸覺與默克爾細胞(Merkel細胞)存在于表皮與真皮交界的網狀脊上，可與感覺傳入神經纖維末梢緊密接觸，在皮膚觸覺高敏感區域數量較多，形成類似于神經解剖上突觸結構，可用于創面修復[5-6]。但是很多細胞工程在修復中容易出現免疫排斥反應，主要在于基質攜帶有組織相容性復合抗原。去細胞異種神經支架采用了化學萃取方法去除異種神經的細胞和髓鞘形成無細胞基質膜管，抑制了異體移植的免疫反應，又能有效地促進損傷神經的再生與修復[7]。且去細胞異種神經支架不受取材限制，具有促進軸突再生，能夠有效減少免疫排斥反應的發生[8]。本文具體探討與分析了去細胞異種神經支架對大鼠足底創面觸覺功能重建的影響，并簡單闡述了相關機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物 清潔級成年雄性Sprague-Dawly大鼠購自上海閔盛醫療科技有限公司，使用許可SYXK(滬)2021-0020。雄性，3月齡，體重180～220 g。所有大鼠均在標準環境下飼養，通風良好，自然采光，每4～6只一籠飼養，普通飼料與墊料，明暗時間設定為12 h∶12 h，可自由攝取食物和水，濕度60%～70%，室溫控制在(22±1)℃。動物實驗經由實驗動物醫學倫理委員會批準，實驗過程中對動物處置符合動物倫理學要求。大鼠在飼養環境中適應7 d后進行后續實驗。

痛覺測試儀購自香港友誠生物科技有限公司；肌源性干細胞、去細胞異種神經支架保存于本實驗室；胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶(批號：S9020、T8150、31600，均購自Solarbio公司)；兔抗大鼠細胞角蛋白-20(Cytokeratin-20，CK-20)單克隆抗體、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體、兔抗大鼠代謝型谷氨酸受體5(Metabotropic glutamate receptors，mGluR5)單克隆抗體(批號：ab76126、ab8226、ab76316，均購自英國Abcam公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012S，購自上海碧云天生物科技有限公司)；多聚甲醛、無水乙醇[批號：441244、1012772，均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司]。

1.2 大鼠足底創面模型的建立 大鼠腹腔內注射4.0%水合氯醛(10.0 ml/kg)，麻醉成功后，0.5%聚維酮碘溶液消毒大鼠足底，然后逐層深切，確保切除深度達筋膜層6 mm×5 mm的皮膚全層，建模后大鼠分籠飼養，從而建立足底全層皮膚缺損大鼠模型。

1.3 大鼠分組與處理 將大鼠足底創面模型(n=48)隨機平分為三組：模型組、干細胞組、神經支架組(肌源性干細胞+去細胞異種神經支架)。模型組不進行治療，干細胞組將培養良好的肌源性干細胞(濃度為107個/ml)細胞懸液注射到創傷部位，神經支架組在干細胞組治療的基礎上以注射植入后的細胞異種神經支架進行橋接，吻合口以9-0絲線吻合。所有大鼠皮下注射抗菌藥物以防止局部感染。

1.4 觀察指標 ①所有大鼠都在治療第7天與第14天進行足底創面機械痛閾測定：將大鼠單獨置于鼠籠中，安靜放置1 h適應周圍環境后，采用弗萊毛分別測試大鼠的機械痛閾(檢測區域固定在足底創面中央)，每種型號弗萊毛刺激10次，以出現5次以上縮腳反應為陽性，其中能夠引發迅速縮腳反應的最小力度為機械性痛閾閾值。②所有大鼠在治療第7天與第14天進行步態測定:測定與記錄足底神經指數，0為正常值，-100為完全離斷。同時用肌電圖儀檢測足底神經的運動神經傳導速度。③三組分別與治療第14天與第21天分別處死8只大鼠，取大鼠足底創面新生肉芽組織，置于4.0%多聚甲醛溶液中后制成病理切片，1.0%鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，樹脂包埋，使用Image 5.0圖像分析軟件進行定量測量，計算與記錄同一平均面積的有髓神經纖維數量。④大鼠足底創面新生肉芽組織，研磨后提取總蛋白，離心后取上清液，進行蛋白定量，上樣后電泳2.5 h，將目的蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h；加入一抗抗體(1∶1000)，孵育(4 ℃，過夜)，TBST洗滌3次，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL顯影后進行曝光，確定目的蛋白的相對表達水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS 23.00統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組均數間比較采用單因素或多因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 機械痛閾變化比較 干細胞組、神經支架組治療第7天與第14天的機械痛閾高于模型組(均P<0.05)，神經支架組高于干細胞組(P<0.05)，見表1。

2.2 足底神經指數與運動神經傳導速度變化比較 干細胞組、神經支架組治療第7天與第14天的足底神經指數與運動神經傳導速度高于模型組(均P<0.05)，神經支架組高于干細胞組(P<0.05)，見表2。

2.3 有髓神經纖維數量變化比較 干細胞組、神經支架組治療第14天與第21天的有髓神經纖維數量高于模型組(均P<0.05)，神經支架組高于干細胞組(P<0.05)，見表3。

表1 三組治療后不同時間點機械痛閾變化比較(g)

表2 三組治療后不同時間點足底神經指數與運動神經傳導速度變化比較

2.4 CK-20與mGluR5蛋白相對表達水平比較 干細胞組、神經支架組治療第14天與第21天的CK-20與mGluR5蛋白相對表達水平低于模型組(均P<0.05)，神經支架組低于干細胞組(P<0.05)，見表4。

3 討 論

皮膚是體內與體外環境接觸的重要媒介，尤其是足底皮膚上存在大量復雜的觸覺感受器，可幫助機體感知外環境的變化刺激。足底創傷在臨床上比較常見，多為外傷導致，其在修復時要求重建感覺[9]。皮瓣修復的成功率比較高，但是很難改善機體的足底感覺功能。隨著醫學技術的發展，運用組織工程技術進行創面修復得到了廣泛應用[10]。肌源性干細胞作為種子細胞用于制備組織化神經在實驗研究中取得了很好的效果。而去細胞基質是近年來在各學科受到重視的生物衍生材料，具有更好的生物相容性，有利于組織、器官的修復[11]。

表4 三組治療后不同時間點CK-20與mGluR5蛋白相對表達水平比較

本研究顯示干細胞組、神經支架組治療第7天與第14天的機械痛閾高于模型組(均P<0.05)，神經支架組高于干細胞組(P<0.05)；干細胞組、神經支架組治療第7天與第14天的足底神經指數與運動神經傳導速度高于模型組(均P<0.05)，神經支架組高于干細胞組(P<0.05)，表明去細胞異種神經支架在大鼠足底創面的應用有利于觸覺功能重建，提高足底神經指數與運動神經傳導速度。從機制上分析，去細胞異種神經支架保留了基底膜、外膜、神經內膜、神經束膜等組織，清除了相關細胞和髓鞘及其碎片，具有完整的神經基底膜管和纖維支架結構，可保護受損神經元生存，降低免疫排斥反應的發生率，從而促進創面觸覺功能恢復[12-13]。

觸覺感受器可以通過機械激活的離子通道等把機械信號轉變為感受器上的電信號形成感受器電位，然后傳輸高級神經中樞，產生觸摸感覺[14]。生物工程材料是指天然生物組織經過特殊處理后形成的一種生物材料，其中去細胞異種神經支架具有很好的安全性，不會引起與加重炎性反應，具有良好的生物相容性與空間結構，適用于組織工程化人工神經的研制[15]。本研究顯示干細胞組、神經支架組治療第14天與第21天的有髓神經纖維數量高于模型組(均P<0.05)，神經支架組高于干細胞組(P<0.05)，表明去細胞異種神經支架在大鼠足底創面的應用能增加有髓神經纖維數量。當前也有研究顯示去細胞異種神經支架促進其分泌神經生長所需活性物質，還可促進神經細胞分裂增殖，從而更有效地促進神經再生修復[16]。并且去細胞異種神經支架還可以通過逆運輸到達相應神經中樞，減少了神經元的凋亡，對中樞神經元與軸突起到一定的保護作用[17]。

CK-20蛋白是反應觸覺功能的重要蛋白，正常大鼠網狀脊或肉芽組織中均有CK-20陽性細胞表達，CK-20蛋白水平降低表明創面新生肉芽組織中Merkel細胞存在丟失，導致神經功能恢復能力下降[18]。mGluR5屬G蛋白偶聯受體超家族成員，可中介中樞神經系統興奮性突觸傳遞，通過神經元的中樞敏化參與神經痛的發生。 GluR5分布于脊髓和大腦的各種結構中，參與疼痛的調控以及對傷害性刺激的有效應答，在疼痛部位注射GluR5受體拮抗劑可以調控局部或全身疼痛反應[19]。去細胞異種神經支架的制作工藝簡便易行，自身通透性好，來源容易，不受取材的限制。去細胞異種神經支架允許各種營養物質在管內外自由交換及血管長入，具有極低的抗原性，同時保留了促進神經再生的營養成分，為神經再生提供有利的微環境[20-21]。本研究顯示干細胞組、神經支架組治療第14天與第21天的CK-20與mGluR5蛋白相對表達水平低于模型組(均P<0.05)，神經支架組低于干細胞組(P<0.05)，表明去細胞異種神經支架在大鼠足底創面的應用能抑制CK-20與mGluR5蛋白的表達。不過本研究也存在一定的不足，動物建模中均使用成年雌性大鼠，未能體現同種族、不同性別的差異性，且大鼠行為存在隨意性，將在后續研究中深入探討。

綜上所述，去細胞異種神經支架在大鼠足底創面的應用能抑制CK-20與mGluR5蛋白的表達，有利于觸覺功能重建，提高足底神經指數與運動神經傳導速度，增加有髓神經纖維數量。