反相高效液相色譜法測(cè)定鯊肝醇片的含量

宋玉琴，宋 青，董 芳

（淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086）

鯊肝醇片是一種升白細(xì)胞藥，臨床上主要用于防治因放射治療、腫瘤化療及苯中毒等引起的粒細(xì)胞減少癥[1]，其主要成分為3-（十八烷氧基）-1,2-丙二醇[2]。《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（化學(xué)藥品及制劑第一冊(cè)）鯊肝醇片含量測(cè)定采用氯仿提取間接滴定法[3]，并用空白試驗(yàn)校正。該方法消耗滴定液的量少，誤差大，準(zhǔn)確度低，且操作繁瑣、專屬性差。目前文獻(xiàn)報(bào)道的鯊肝醇片含量測(cè)定方法有高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）[4]、氣相色譜法[5]、容量分析法[6]、近紅外光譜法[7]。HPLC-ELSD定量需采用對(duì)數(shù)指數(shù)法進(jìn)行計(jì)算，且基線易漂移、噪音大；氣相色譜法需使用內(nèi)標(biāo)物，成本較高；容量分析法只是稍作變化，并無實(shí)質(zhì)性改進(jìn)；近紅外光譜法數(shù)學(xué)模型的建立難度大，模型的好壞直接影響預(yù)測(cè)的結(jié)果和以后的使用。本文采用HPLC紫外檢測(cè)法測(cè)定鯊肝醇片的含量，結(jié)果表明該方法普及度高、操作簡便、分析速度快、準(zhǔn)確度高。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀，包括LC-20AT型四元梯度泵、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A型柱溫箱、LC solution色譜數(shù)據(jù)工作站（日本Shimadzu公司）；CP225D十萬分之一天平（德國Sartorius公司）；超純水儀（美國Millipore）。

1.2 試藥

鯊肝醇原料藥（含量99.8 %，江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司）；鯊肝醇片（批號(hào)：1912111，1912112，1912113，規(guī)格20 mg，江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司）；甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），水為純化水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（90:10）；檢測(cè)波長：200 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品貯備液：精密稱取鯊肝醇原料藥適量，用甲醇配制成含鯊肝醇10.4 mg/ml的溶液，搖勻。

對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋制成含鯊肝醇1.04 mg/ml的溶液，搖勻。

供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取片粉適量（約相當(dāng)于鯊肝醇20 mg），置于20 ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

空白溶液：精密稱取處方比例的空白輔料，置于20 ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果顯示，鯊肝醇理論板數(shù)＞8000，與空白輔料峰分離度均＞1.5，表明空白輔料不干擾測(cè)定，色譜條件的專屬性良好，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖譜

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品貯備液（10.4 mg/ml）0.25，0.5，1.0，2.0，5.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果回歸方程為y=789 293x+18 654（r=0.9999），表明鯊肝醇檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.26～5.2 mg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得鯊肝醇峰面積的RSD分別為0.5 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：1912111），分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果峰面積的RSD為0.6 %（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：1912111）平行制備6份供試品溶液并測(cè)定，測(cè)得鯊肝醇片含量的平均值為99.8 %，RSD為0.6 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：1912111），精密稱取片粉（約相當(dāng)于鯊肝醇10 mg）6份，分別置于20 ml量瓶中，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為98.73 %（RSD=0.84 %，n=6），表明方法準(zhǔn)確度較好，詳見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。信噪比為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度為檢測(cè)限，測(cè)得鯊肝醇的檢測(cè)限為775 ng/ml；信噪比為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，測(cè)得定量限為2.58 μg/ml。

2.10 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)樣品，每批樣品取3份，按本文建立方法和部頒標(biāo)準(zhǔn)方法分別測(cè)定含量，兩種方法含量測(cè)定平均值分別為100.1 %，92.2 %，RSD值分別為0.26 %，1.85 %；結(jié)果表明該方法較標(biāo)準(zhǔn)方法含量測(cè)定結(jié)果偏高，誤差較小。詳見表2。

表2 兩種方法含量測(cè)定結(jié)果比較（%）

2.11 耐用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液和供試品溶液，在其他色譜條件不變的情況下，分別改變流速、流動(dòng)相比例、柱溫、檢測(cè)波長、色譜柱品牌，分別測(cè)定樣品含量（批號(hào)：1912111），結(jié)果表明該色譜條件耐用性良好。詳見表3。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

鯊肝醇原料藥溶解度試驗(yàn)表明：鯊肝醇在甲醇中溶解度較好，乙腈次之，乙腈-水最差，且由于鯊肝醇結(jié)構(gòu)中含兩個(gè)醇羥基，根據(jù)相似相溶的原理最終選用甲醇作為溶劑；經(jīng)掃描，鯊肝醇在200 nm附近有最大吸收，故選擇200 nm為測(cè)定波長；其結(jié)構(gòu)中含十八烷氧基，與C18柱固定液結(jié)構(gòu)相似，因此選用C18柱為色譜柱；由于甲醇末端吸收嚴(yán)重，故選用乙腈-水作為流動(dòng)相，且隨著乙腈比例的減小，出峰時(shí)間延長，峰展寬嚴(yán)重，乙腈比例過高，主峰與輔料峰又難以達(dá)到基線分離，只有當(dāng)乙腈-水比例為90:10時(shí)，既可達(dá)到基線分離，又可避免峰展寬。本文建立的測(cè)定鯊肝醇片含量的HPLC法，較部頒標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果更接近處方投藥量且重復(fù)性好。該方法提取完全，操作簡便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可用于鯊肝醇片的質(zhì)量控制。