基于HPLC指紋圖譜研究60Co-γ輻射滅菌對燒傷靈酊有效成分的影響

吳 妹，林觀昊，黃 妹

（海口市中醫醫院 藥學部，海南 海口 570100）

中藥成分復雜多樣，微生物含量高，滅菌操作是中藥及其制劑生產過程中的關鍵環節。近年，中藥輻照滅菌技術得到廣泛應用。60Co-γ輻射滅菌具有可常溫滅菌、可對完整包裝滅菌、可靈活調整滅菌劑量進行連續滅菌等優勢[1-2]，在中藥滅菌中應用廣泛。

燒傷靈酊是由虎杖、黃柏、冰片三味中藥材原粉經加工而成的臨床常用外用酊劑，具有清熱燥濕、解毒消腫、收斂止痛之功效，臨床主要用于I、II度燒傷[3]。方中以具有清熱利濕、活血通絡功效的虎杖為君藥，其主要物質基礎為二苯乙烯類（白藜蘆醇和虎杖苷）、蒽醌類（大黃素、大黃素甲醚）及黃酮類等[4-5]。臣藥黃柏清熱燥濕、瀉火解毒，鹽酸小檗堿為其抗菌的有效成分[6-7]，2020年版《中國藥典》將其作為含量測定指標成分。2015年11月國家食品藥品監督管理局頒布了《中藥輻照滅菌技術指導原則》，規定中藥采用輻照滅菌需遵守“安全、有效、穩定”的原則。目前尚無文獻報道60Co-γ輻射滅菌對燒傷靈酊中化學成分穩定性有影響。中藥指紋圖譜技術具有整體性、特征性等特點，能較全面地反映中藥復方制劑的物質基礎，可更全面客觀地評價中藥復方制劑的輻照滅菌技術[8-9]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了燒傷靈酊的指紋圖譜，確定了共有指紋峰，并對虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿5個化學成分進行含量測定。通過比較不同60Co-γ輻照劑量對燒傷靈酊有效成分穩定性的影響，確定合適的60Co-γ輻射滅菌輻照劑量，以期為該藥物的質量控制提供依據。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），包括在線脫氣機，四元梯度泵，自動進樣器，VWD-G1314C檢測器，Agilent-ChemStation數據處理系統；60Co-γ射線輻照設備（咸陽華科輻照技術有限公司）；AUW-220D型電子天平（d=0.01 mg，日本島津公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率500 W，頻率50 kHz）。

1.2 試藥與試劑

虎杖苷（批號：111575-201603，含量：87.3 %），大黃素（批號：110756-201913，含量：96.0 %），白藜蘆醇（批號：111535-201703，含量：99.4 %），大黃素甲醚（批號：110758-201817，含量：99.2 %），鹽酸小檗堿（批號：110713-201814，含量：86.7 %，中國食品藥品檢定研究院）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號：190914），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號：190328），pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：191026，北京三藥科技開發公司）；甲醇、乙腈為色譜純（德國默克公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

燒傷靈酊（河北奧星集團藥業有限公司，規格：50 ml/瓶，編號：S1～S11，批號：20190111，20190216，20190309，20190426，20190524，20190611，20190906，20190923，20191015，20191118，20191210）。

2 方法與結果

2.1 輻照滅菌

《中藥輻照滅菌技術指導原則》（2015年版）規定中藥60Co-γ射線輻射滅菌劑量應不大于10 kGy，故本研究分別以 0，3，6，9 kGy劑量輻照處理樣品。

2.2 滅菌效果檢查

參照《中國藥典》2 0 2 0年版四部通則1105“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”進行不同輻照劑量前后樣品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數考察。取11批輻照前后燒傷靈酊，制成1:10，1:100，1:1000的待測液，依法測定。需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數測定結果見表1。說明60Co-γ射線輻射滅菌處理后，需氧菌及霉菌和酵母菌總數均大幅度減少，且符合中國藥典[10]規定：皮膚給藥制劑中需氧菌總數不得超過102cfu/g，霉菌和酵母菌總數不得超過102cfu/g。結果表明60Co-γ射線輻射對燒傷靈酊有很好的微生物殺滅作用。

表1 燒傷靈酊輻照前后含菌量測定結果

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿對照品適量，以甲醇為溶劑配制成虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿濃度分別為204.38，351.07，189.85，233.69，92.16 μg/ml的混合對照品溶液，0.45 μm濾膜濾過，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 取燒傷靈酊3瓶，混勻，精密量取5 ml，置100 ml棕色量瓶中，加甲醇-稀鹽酸（99:1）溶液80 ml，20 ℃超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）40 min，取出，再用甲醇-稀鹽酸（99:1）溶液定容至100 ml，搖勻，濾過，取續濾液，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.4 色譜條件及系統適用性實驗[11-13]

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.5 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，15 %A；20～25 min，15 %→30 %A；25～35 min，30 %→55 %A；35～50 min，55 %→85 %A；50～60 min，85 %→15 %A）；檢測波長：265 nm（20～25 min，鹽酸小檗堿），287 nm（0～20 min，虎杖苷；25～60 min，大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚）；流速1.0 ml/min；柱溫28 ℃，進樣量10 μl。按上述色譜條件測定，結果各色譜峰與相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，理論塔板數均大于5500，系統適用性良好。

2.5 燒傷靈酊HPLC指紋圖譜研究

2.5.1 穩定性試驗 取燒傷靈酊（批號：20190611，輻照劑量：0 kGy），按2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別放置0，3，6，9，15，20，24 h，按2.4項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，并導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”（2012A版）軟件處理，計算7次采集的指紋圖譜（以0 h進樣的色譜圖為參照圖譜）相似度，結果各指紋圖譜間相似度均大于0.96，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定。

2.5.2 重復性試驗 取燒傷靈酊（批號：20190611，輻照劑量：0 kGy）6份，按2.3.2項下方法處理，按2.4項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，并導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”（2012A版）軟件處理，計算6次采集的指紋圖譜（以第1次進樣的色譜圖為參照圖譜）相似度，結果各指紋圖譜間相似度均大于0.95，表明方法重復性良好。

2.5.3 燒傷靈酊指紋圖譜的建立 取11批經0，3，6，9 kGy劑量輻照處理的燒傷靈酊供試品適量，按2.3.2項下方法處理，按2.4項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。分別將不同劑量處理的11批燒傷靈酊色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統”（2012A版）軟件，建立指紋圖譜，設置時間窗為0.5 min，采用中位矢量法多點校正，全譜段峰匹配，生成對照圖譜。指紋圖譜及共有模式見圖1。

圖1 不同劑量輻照后燒傷靈酊HPLC指紋圖譜和混合對照品圖譜

2.5.4 指紋圖譜共有峰指認及相似度評價 取供試品指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012A版）軟件，以未輻照（0 kGy）樣品圖譜為參照，經多點校正，全譜段峰匹配，生成對照圖譜，分別計算11批次樣品經不同劑量輻照后指紋圖譜與對照圖譜的相似度，結果見表2。

表2 相似度計算結果

經0，3，6，9 kGy劑量輻照處理的燒傷靈酊指紋圖譜，均可確定22個共有色譜峰，且共有峰總面積占色譜圖總峰面積的95 %以上，因此確定這22個色譜峰為燒傷靈酊指紋圖譜共有峰，與2.3.1項下對照品比對，確認3號峰為虎杖苷、7號峰為鹽酸小檗堿、9號峰為白藜蘆醇、14號峰為大黃素、16號峰為大黃素甲醚。

2.6 燒傷靈酊中5個成分定量分析

2.6.1 線性關系考察 分別精密吸取2.3.1項下混合對照品溶液1，2，4，6，8，12 ml，分別置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液，按2.4項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標（X，μg/ml），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，繪制各組分標準曲線，計算相應回歸方程和相關系數（r）。結果表明：虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿質量濃度與峰面積在試驗范圍內成良好的線性關系；取混合對照溶液，用甲醇倍比稀釋，按2.2項下色譜條件進樣分析，分別取峰面積信噪比為10倍（S/N=10）或3倍（S/N=3）時相應對照品濃度為定量限（LOQ）和檢測限（LOD）。結果見表3。

表3 5個成分線性回歸方程

2.6.2 精密度試驗 取2.3.1項下混合對照品溶液，按2.4項下色譜條件連續進樣5次，記錄色譜圖并計算5個成分峰面積RSD值。結果虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿峰面積RSD（n=5）分別為0.16 %，0.37 %，0.42 %，0.29 %，0.51 %，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩定性試驗 取2.3.2項下燒傷靈酊供試品（批號：20190611，輻照劑量：0 kGy）溶液，分別放置0，3，6，9，15，20，24 h，按2.4項下色譜條件分析，記錄色譜圖并計算5個成分峰面積RSD值。結果虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿峰面積的RSD（n=7）分別為0.78 %，0.69 %，0.75 %，0.89 %和1.01 %，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定。

2.6.4 重復性試驗 取燒傷靈酊供試品（批號：20190611，輻照劑量：0 kGy）6份，按2.3.2項下方法處理，按2.4項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖并計算5個成分含量及相應RSD值。結果虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿的含量平均值分別為0.4537，0.5451，0.4115，0.5023，0.2042 mg/ml，RSD（n=6）分別為0.89 %，0.78 %，0.91 %，0.97 %，1.03 %，結果表明方法重復性良好。

2.6.5 加樣回收試驗 精密量取燒傷靈酊供試品（批號：20190611，輻照劑量：0 kGy）9份，每份2.50 ml，分為3組，每組3份，每組按虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿含量的80 %、100 %和120 %精密加入混合對照品，按2.3.2項下方法處理，按2.4項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖并計算各有效成分回收率。結果虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.58 %，100.03 %，99.73 %，99.56 %，99.09 %，RSD分別為0.57 %，0.88 %，0.98 %，0.99 %，0.86 %（n=9），表明本方法回收率良好。結果見表4。

表4 燒傷靈酊中5個成分的加樣回收試驗結果（n=9）

2.6.6 樣品測定 分別取11批經0，3，6，9 kGy劑量輻照處理的燒傷靈酊供試品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.4項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算5個成分含量，結果見表5。

表5 燒傷靈酊5個成分含量測定結果

3 討論

3.1 色譜條件的優化

本研究采用DAD檢測器在190～400 nm掃描燒傷靈酊光譜，結果鹽酸小檗堿在265 nm處，虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇及大黃素甲醚在287 nm處有最大吸收，因此采用287 nm（0～20 min）、265 nm（20～25 min）、287 nm（25～60 min）作為燒傷靈酊指紋圖譜分析及5個成分含量測定的檢測波長。在流動相選擇時，先后考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %磷酸、甲醇-0.5 %磷酸、乙腈-0.1 %磷酸和乙腈-0.5 %磷酸6種流動相系統，最后選擇乙腈-0.5 %磷酸系統作為流動相，得到的指紋圖譜色譜峰數量最多；還對色譜柱Waters XTERRA C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Kromasil C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）進行了考察，結果以Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱分離色譜峰基線平穩，分離效果好。

3.2 結果分析

60Co-γ輻照滅菌是利用γ射線直接或間接作用于生物分子，通過破壞和改變生物大分子的結構，從而抑制或殺滅微生物[14]。本文按《中藥輻照滅菌技術指導原則》規定，中藥最大輻照滅菌劑量不超過10 kGy的原則，選定3，6，9 kGy 3個輻照劑量對燒傷靈酊進行輻照處理，考察60Co-γ輻照滅菌對其指紋圖譜及化學成分含量的影響。結果表明，經不同劑量輻照處理后的樣品指紋圖譜共有峰數量沒有變化；經3，6 kGy輻照處理后的樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度均大于0.975，而經9 kGy輻照處理后的樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度平均值僅為0.8223。采用SPSS 22.0軟件對5個化學成分的含量進行獨立樣本t-檢驗，分析5個化學成分經3，6，9 kGy輻照滅菌后與的含量變化。結果顯示輻照劑量為6 kGy及以下時，虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿含量變化無統計學意義（P＞0.05）。當輻照劑量達9 kGy時，白藜蘆醇和大黃素甲醚的含量較未輻照時分別降低63.36 %和79.65 %，含量變化有統計學意義（P＜0.05）。白藜蘆醇含多個羥基和烯鍵，化學性質不穩定，在γ射線作用下發生異構化降解，部分轉化為虎杖苷，導致虎杖苷的含量較未輻照時有所增加[15]；而具有苯甲氧基結構的大黃素甲醚，在γ射線輻照下易發生氫化反應，含量降低[16]。

4 結論

本研究建立的指紋圖譜及含量測定方法經方法學驗證，可用于分析經不同劑量輻照滅菌后的燒傷靈酊指紋圖譜和虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿5個化學成分含量測定。研究結果顯示燒傷靈酊60Co-γ輻照滅菌劑量不得超過6 kGy，為燒傷靈酊采用60Co-γ輻照滅菌可行性提供理論參考。