HPLC法測定皮膚角質層貼片中3種保濕物質含量

于 夢，孫 玲，張 云，孟祥璟

（山東省藥學科學院，山東 濟南 250101）

人體皮膚中起保濕作用的物質稱為天然保濕因子（NMF）[1-2]，NMF主要由游離氨基酸及其代謝產物（如吡咯烷酮羧酸和尿刊酸）組成[3]。吡咯烷酮羧酸（PCA）是谷氨酰胺的代謝產物[4]，作為一種具有優良吸濕性能的保濕劑大量存在于皮膚角質層中[5]。尿刊酸（UCA）是組氨酸的咪唑丙烯酸衍生物[6]，以反式（trans-UCA）存在于皮膚角質層中，在紫外線作用下會由反式轉變成順式（cis-UCA），從而對皮膚起一定的防護作用[7-8]。在干燥和鱗片狀的皮膚中，經常觀察到較低水平的吡咯烷酮羧酸和尿刊酸[9]。

國內外關于吡咯烷酮羧酸、尿刊酸測定的文獻報道中，前處理過程有的使用大比例水相提取后氮吹濃縮，有的使用加入丙二醇的PBS溶液提取，有的使用堿性溶劑提取后中和，然后采用C18色譜柱進行分離，使用紫外檢測器和質譜檢測器進行檢測[10-17]。已有的方法提取過程繁瑣復雜，在C18柱分離時存在吡咯烷酮羧酸與溶劑峰分不開的問題。有人為避免溶劑干擾而使用多波長切換檢測，或使用質譜檢測器進行檢測。本文建立的皮膚貼片的處理檢測方法，超聲提取后直接進樣，使用紫外檢測器進行檢測，極大簡化了樣品的前處理過程，解決了同一色譜條件下主成分與溶劑峰、雜質峰分不開等問題。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Angilent1260高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（美國安捷倫）； AE240萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；XS205DU十萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Seven Excellence多參數測定儀（梅特勒-托利多公司）；TGL-16gR離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥

吡咯烷酮羧酸鈉（批號：Y05D9S76767，純度≥98 %），反式尿刊酸（批號：205D9H76812，純度：98 %），順式尿刊酸（批號：105D9J76856，純度≥98 %，上海源葉）；甲醇（色譜純，天津康科德）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團）；庚烷磺酸鈉（色譜純，山東禹王）；磷酸（色譜純，天津市科密歐）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo BetaBasic Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調節pH至2.5）（3:97）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：20 ℃；進樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取皮膚貼片樣品1片，置于2 ml具塞離心管中，膠黏劑一面朝內，加0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調節pH至2.5）1.0 ml，超聲30 min，離心，取上清，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取吡咯烷酮羧酸鈉50.47 mg，反式尿刊酸10.21 mg和順式尿刊酸10.33 mg，分別置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為各對照品儲備液。分別精密量取各對照品儲備液1 ml，置同一100 ml量瓶中，用0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調節pH至2.5）稀釋至刻度，配成每1 ml分別含吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸各50.47 μg，10.21 μg，10.33 μg的混合對照品儲備液。將混合對照品儲備液稀釋10倍，即得對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 取空白膠帶1片，加0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調節pH至2.5）1.0 ml，超聲30 min，離心取上清，作為陰性樣品溶液。

2.3 專屬性

取陰性樣品溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μl，按2.1項色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖1。結果表明，陰性樣品溶液在吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸出峰位置無干擾。

圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

2.4 檢測限和定量限

取對照品溶液逐步稀釋，至各成分的信噪比S/N接近10作為定量限，至各成分的信噪比S/N接近3作為檢測限。結果，吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸的定量限分別為0.1009，0.02042，0.02066 μg/ml，吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸的檢測限分別為0.05045，0.01021，0.01033 μg/ml。

2.5 溶液穩定性試驗

取同一份對照品溶液，分別在0，1，4，8，12，24 h進樣，記錄色譜圖，觀察待測成分峰面積的變化情況。結果吡咯烷酮羧酸鈉峰面積的RSD為0.36 %，反式尿刊酸峰面積的RSD為0.48 %，順式尿刊酸峰面積的RSD為0.64 %，表明對照品溶液在24 h內穩定。

2.6 線性關系考察

取混合對照品儲備液，逐級稀釋，制成線性供試品溶液。按2.1項色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，分別得回歸方程。線性試驗結果表明，吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸在相應濃度范圍內與其峰面積呈良好的線性關系，結果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

2.7 精密度試驗

2.7.1 重復性 取空白膠帶6張，分別加入混合對照品儲備液0.1 ml并晾干，按2.2.1項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，外標法計算各待測成分含量，并計算RSD。結果顯示，吡咯烷酮羧酸鈉含量的RSD為1.01 %，反式尿刊酸含量的RSD為0.69 %，順式尿刊酸含量的RSD為0.93 %，表明方法重復性良好。

2.7.2 中間精密度 為考察隨機變動因素對精密度的影響，在不同日期由不同人員另取空白膠帶6張，分別加入混合對照品儲備液0.1 ml并晾干，按2.2.1項下方法制備6份供試品溶液，在不同高效液相色譜儀上按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，外標法計算各待測成分含量。本試驗結果與重復性結果共計12份樣品中吡咯烷酮羧酸鈉含量的RSD為0.98 %，反式尿刊酸含量的RSD為0.86 %，順式尿刊酸含量的RSD為1.14 %。由結果可知，方法中間精密度良好。

2.8 加樣回收試驗

取空白膠帶3張，分別加入混合對照品儲備液（吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸濃度分別為50.48，10.24，10.22 μg/ml）0.1 ml并晾干，按2.2.1項下方法制備3份供試品溶液，作為100 %水平供試品，同法制備50 %和150 %水平供試品各3份，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，計算待測成分的回收率。測得吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸的回收率分別為92.67 %，98.49 %，98.95 %，RSD分別為2.61 %，1.16 %，0.67 %，表明該方法的準確度良好，結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）

2.9 耐用性試驗

取空白膠帶1張，加入混合對照品儲備液0.1 ml并晾干，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，作為耐用性樣品溶液。分別改變色譜條件中鹽的pH值、離子對試劑濃度、有機相比例、柱溫、檢測波長及流速，取耐用性樣品溶液和對照品溶液進樣，記錄峰面積，外標法計算含量。結果各峰之間分離度均大于1.5，含量的RSD小于2 %，表明本方法的耐用性良好。具體結果見表3。

表3 耐用性試驗結果

2.10 樣品測定

取10批樣品，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，按外標法計算供試品溶液中3種待測成分的含量。樣品測定結果見表4。

表4 樣品測定結果

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

目前分離吡咯烷酮羧酸鈉和尿刊酸的色譜柱主要為C18柱[10-17]，實驗考察了Agilent ZOBAX SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shim-Pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XTerra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對目標物的分離情況。通過減少有機相比例、調整pH值及加入離子對試劑等方式進行試驗，結果均顯示吡咯烷酮羧酸鈉與溶劑峰無法分離。經分析，吡咯烷酮羧酸鈉的結構中存在較大共軛體系，在苯基柱上可能有較好選擇性，因此改用苯基柱進行試驗。通過試驗發現，吡咯烷酮羧酸鈉在Thermo苯基柱上保留較好，與溶劑峰可實現較好分離，因此本文選擇Thermo BetaBasic Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行實驗。

3.2 流動相的選擇

為增加吡咯烷酮羧酸鈉的保留，選擇甲醇-磷酸二氫鉀緩沖鹽體系進行試驗，但效果并不理想。后加入離子對試劑庚烷磺酸鈉，通過調整流動相比例及離子對試劑的濃度，吡咯烷酮羧酸鈉可與溶劑峰實現完全分離，但峰形較差，且樣品中吡咯烷酮羧酸鈉峰會與部分雜峰重疊。后續研究發現，降低pH值可顯著改善峰形并適當延長保留時間，從而使吡咯烷酮羧酸鈉能與溶劑峰和樣品中的雜峰實現較好分離。因此，實驗最終選擇甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調節pH至2.5）（3:97）為流動相，此條件下目標分析物分離度好，基線平穩。

3.3 提取溶劑的選擇

為了簡化提取過程，盡量減少中和、濃縮等提取過程，考察了不同提取溶劑對皮膚貼片中的吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸提取后離心直接進樣的效果。以加入一定量的吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸的空白皮膚貼片作為樣品，分別用甲醇、不同體積比的甲醇-水溶液和0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調節pH至2.5）對其進行相同時間的超聲提取。結果表明，使用甲醇進行提取時吡咯烷酮羧酸鈉提取回收率較低，使用不同體積比的甲醇-水溶液進行提取時反式尿刊酸和順式尿刊酸峰形較差，分別分裂為兩個峰。使用0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調節pH至2.5）作為提取溶劑時，吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸都能很好的分散在提取溶劑中，且目標峰的峰形較好，提取回收率在90 %以上。

本文建立了皮膚角質層貼片中吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸和順式尿刊酸含量測定的HPLC方法。結果表明，該方法樣品處理過程簡便，可操作性強，可實現同一色譜條件下吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸、順式尿刊酸與溶劑峰及其他皮膚成分色譜峰的較好分離，靈敏度高，重復性好，可用于皮膚角質層貼片中吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸和順式尿刊酸的準確測定。