昆侖Ⅰ號稀釋液中添加恩諾沙星濃度篩選研究

朱文靚，王淼，王杰，崔寶山 ，劉嘉偉，賈小東，高慶華*

（1塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木大學生命科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300）

（3塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

精液中細菌會抑制精子運動，降低精子的活力，導致細胞結構異常，影響精液的保存時長，甚至導致細胞凋亡，還可能會使母畜感染生殖系統疾病，威脅到畜群［1-3］。國外學者研究發現細菌會導致精子質量下降，使得精子濃度降低，喪失運動力，精子形態異常，頂體受損等［4］。研究者為了降低精液中細菌造成的危害，通常在稀釋液中添加以青鏈霉素為主的抗生素［5］。青鏈霉素作為廣譜抗生素能夠抑制革蘭氏陽性菌［6］，但也有研究表明從精液中分離出的細菌對鏈霉素和青霉素具有耐藥性［7］。恩諾沙星是一種殺菌藥物，對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原菌均有較強的抑制作用，通過阻斷DNA復制的旋轉酶，破壞細胞核酸合成，迅速殺滅病原菌，優于青鏈霉素［8-9］。目前，恩諾沙星已用于豬（50 μg/L）［9］、牛（400 μg/mL）［10］、山羊（50 μg/mL）［11］的精液稀釋液中，但鮮有綿羊精液稀釋液中添加恩諾沙星的相關報道，也沒有統一的添加量。本試驗室研發的Tris-卵黃專利稀釋液（昆侖Ⅰ號稀釋液），用于綿羊精液低溫保存，能有效保存綿羊精液10 d。因此，本研究將0 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL的恩諾沙星分別添加進昆侖Ⅰ號稀釋液中，并檢測其低溫保存綿羊精液的效果，確定恩諾沙星適宜添加劑量，為后期的深入研究奠定基礎。

1 材料

1.1 樣品及主要試劑

綿羊精液采自塔里木大學動物科學與技術學院實訓基地具有正常繁殖能力的3只健康公羊（3～4歲）；Tris、檸檬酸、三磷酸腺苷（ATP）、維生素C、牛血清白蛋白（BSA）購自北京博奧拓達科技有限公司；果糖、海藻糖購自上海源葉生物科技有限公司；恩諾沙星、姬姆薩染液均購自北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉購自天津致遠化學試劑有限公司；牛肉膏購自北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨購自賽默飛世爾科技公司；瓊脂粉購自上海山浦化工有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺（SHC-CT-22，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；熒光倒置顯微鏡（T1-SM，尼康公司）；電熱恒溫培養箱（DHP-9272，上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3 溶液配制

稀釋液配制：按照昆侖Ⅰ號稀釋液配方稱取，去除稀釋液中的青鏈霉素成分，添加不同濃度的恩諾沙星，用三蒸水溶解，磁力攪拌器攪拌30 min后，分裝放入-80℃冰箱避光冷凍保存待用。

福爾馬林磷酸鹽固定液配制：稱取磷酸氫二鈉2.25 g、磷酸二氫鈉0.55 g，加入30 mL生理鹽水，30℃靜置3 h溶解，再加入經碳酸鎂飽和的甲醛8 mL，用生理鹽水定容至100 mL。

姬姆薩染液配制：按照姬姆薩濃縮液與姬姆薩稀釋液1:4的比例配制。

培養基的制備：稱取牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀0.5 g、氯化鈉2.5 g、瓊脂粉10 g放入燒杯中，溶解后用蒸餾水定容至500 mL，過濾、分裝入250 mL錐形瓶，并用瓶塞塞住，高壓待用。

2 方法

2.1 試驗設計

本試驗將5個不同濃度的恩諾沙星（E0：0 μg/mL；E25：25 μg/mL；E50：50 μg/mL；E75：75 μg/mL；E100：100 μg/mL）添加于昆侖Ⅰ號稀釋液中，在低溫保存綿羊精液第0 d，2 d，4 d，6 d，8 d，10 d，12 d時對精子活力、頂體完整率及細菌數進行檢測并比較，每個樣本檢測3次。

2.2 樣品采集及稀釋保存

使用電刺激采精法進行精液采集，采集的精液放入保溫裝置中迅速送至試驗室。將合格的精液按適宜的稀釋比例稀釋后，在2 h內緩慢降至0℃，并保存在冰水混合物中。

2.3 精液品質檢測

精子活力檢測：將保存的精液輕輕混勻，吸取10 μL精液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于37℃載物臺上，在400倍視野下觀察并計數。

精子頂體完整率檢測：將保存的精液輕輕混勻，吸取10 μL精液滴于載玻片上，用另一潔凈載玻片將其制成抹片，自然風干，用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15 min，蒸餾水沖洗，自然風干，姬姆薩染液染色90 min，蒸餾水沖洗，干燥待檢。

精液細菌數檢測：將保存的精液輕輕混勻，吸取100 μL精液于生理鹽水中稀釋至20倍待用，在超凈工作臺中的酒精燈火焰旁操作，每個培養皿中倒入15 mL左右培養基，在培養基未凝固時加入100 μL稀釋后的精液，混勻，凝固后放入37℃培養箱中倒置培養48 h。

2.4 數據統計與分析

數據使用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析，結果用“平均值±標準差”表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

3 結果

3.1 添加恩諾沙星稀釋液低溫保存的綿羊精子活力

如表1所示，隨著低溫保存時間的增長，精子活力逐漸下降；E75組精子在低溫保存至12 d時精子活力達到50%以上，且E75組精子活力在每一天均高于其余4組，從第8 d開始極顯著高于其余4組（P<0.01）；E0組精子活力除第0 d外，均低于其余4組，從第6 d開始極顯著低于E50組和E75組（P<0.01）。

表1 低溫保存綿羊精液不同時間的精子活力 %

3.2 添加恩諾沙星稀釋液低溫保存的綿羊精子頂體完整率

精子頂體完整效果見圖1，精子頂體完整率變化情況見表2。由表2可見，5組添加不同濃度恩諾沙星的稀釋液低溫保存綿羊精液隨著低溫保存時間的增長，精子的頂體完整率呈現不斷下降的趨勢；從第6 d開始E0組精子頂體完整率顯著低于其余4組（P<0.05）；E75組精子頂體完整率僅在第10 d顯著高于其余4組（P<0.05），其他天數均與E25、E50、E100組差異不顯著（P>0.05）。

表2 低溫保存綿羊精液不同時間的精子頂體完整率 %%

圖1 精子頂體完整效果圖（400×）

3.3 添加恩諾沙星稀釋液低溫保存綿羊精液的細菌數

如圖2所示，E0組稀釋液低溫保存綿羊精液的細菌總數隨著保存時間的增加逐漸增加，其余4組細菌數總體呈現先下降后上升的趨勢，但5組精液的細菌菌落數均在國家標準范圍內；E0組精液細菌菌落數從第4 d開始極顯著高于其余4組（P<0.01）。

圖2 低溫保存綿羊精液不同時間的細菌數

4 討論

本試驗是在昆侖Ⅰ號稀釋液中添加5組不同濃度的恩諾沙星低溫保存綿羊精液，分別在不同天數檢測精子活力、頂體完整率及細菌數。從試驗結果可以看出，隨著低溫保存時間的增長，精子活力與頂體完整率呈現逐漸下降趨勢，E75組精子活力在低溫保存至12 d時仍能達到國家鮮精輸精標準，5組精液的細菌數均在國家標準范圍內。

恩諾沙星對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原菌都具有抗菌活性，對廣譜需氧菌和一些兼性厭氧菌具有殺菌作用［10］，并且恩諾沙星對于精液中的大腸桿菌具有良好的抗菌能力［9］。有研究表明恩諾沙星具有藥效穩定、迅速滅菌、無毒的優點［8］。從本試驗結果可以看出5組稀釋液低溫保存綿羊精液精子活力隨著保存時間的增長而下降，E0組精子活力在第8 d就已降至50%以下，這可能是因為E0組稀釋液中并未添加任何抗生素，精液中細菌增多，細菌可能會與精子競爭，導致精子能量耗竭，降低了精子的活力，這與AKHTER S等［12］研究結果相似；E50組精子活力在10 d內能達到國家鮮精輸精標準，與王杰等［13-14］、趙建清等［15］的研究結果相符；添加75 μg/mL恩諾沙星稀釋液組（E75）精子活力能在12 d內達到50%以上，而添加100 μg/mL恩諾沙星稀釋液組精子活力在第10 d就已降到45%，這說明稀釋液中添加適當濃度的抗生素能夠抑制精液中微生物的生長和繁殖，從而延長精液保存時間，改善保存精液的品質［16］，且稀釋液中抗生素的添加劑量必須有一定的限度。有研究表明精液中含有大腸桿菌會損害精子頂體，而本次試驗發現E0組精子從第6 d開始頂體完整率顯著低于其余四組（P<0.05），這可能是因為E0組稀釋液未添加恩諾沙星，而恩諾沙星能夠抑制大腸桿菌的生長［9］，ANDRABI S M等［17］發現添加適當恩諾沙星的稀釋液保存精子會使精子頂體完整性更高，這與本試驗發現稀釋液中添加75 μg/mL恩諾沙星低溫保存綿羊精液精子頂體完整率高于其余4組的結果相似。

我國國家標準GB/4143—2008《牛冷凍精液》中明確規定，每劑量牛冷凍精液中細菌數最多不得超過1 000個［18］，GB/20557—2006《山羊冷凍精液》中規定，山羊冷凍精液細菌數不得超過800個［19］，在本試驗中，5組稀釋液低溫保存綿羊精液細菌數在12 d內均符合國家標準所規定范圍；ZHANG J等［20］研究發現精液可能會在精液采集和加工儲存過程中被細菌污染，精液中存在細菌會對精液質量和生育力有負面影響，本試驗中添加恩諾沙星的處理組隨低溫保存時間的增長細菌數呈現先下降后上升的趨勢，細菌數上升，精子活力下降，這與WANG H等［21］研究結果相一致。E0組精液稀釋液低溫保存綿羊精液細菌數除第1 d外均高于其余4組，從第4 d開始極顯著高于其余4組，這是因為E0組稀釋液中并未添加恩諾沙星，而恩諾沙星能夠通過抑制DNA的合成從而對廣泛的病原菌具有殺菌作用，對革蘭氏陽性病原菌與革蘭氏陰性病原菌均有殺菌作用［22］；本試驗結果表明添加75 μg/mL恩諾沙星的昆侖Ⅰ號稀釋液低溫保存綿羊精液的效果較優，與茆達干等［11］研究發現在稀釋液中添加50 μg/mL恩諾沙星低溫保存波爾山羊精液效果較好的結果不同，可能是因為稀釋液成分不一致，并且其并未對恩諾沙星的添加劑量進行篩選。本試驗確定了恩諾沙星適宜添加劑量，為后續研究卵黃稀釋液中添加恩諾沙星低溫保存綿羊精子效果研究奠定一定基礎。

5 結論

本試驗在昆侖Ⅰ號稀釋液中添加75 μg/mL恩諾沙星低溫保存綿羊精液效果最優，精子活力在第12 d仍能達到50%以上，可對綿羊精液進行低溫長效保存。