應用綠色液相色譜法定量檢測發酵液中的乙醇

程嬌梅，齊祥明，郭曉華

(1.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266000；2.青島蔚藍生物股份有限公司，山東 青島 266000；3.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276826)

1 引言

乙醇是很多酒精發酵液中的重要甚至是主要目標產物，乙醇含量往往是對這些發酵過程進行表征的重要指標之一。因此，快速、準確地測定乙醇含量對這類發酵工藝的優化與控制具有重要意義。傳統的乙醇含量測定方法主要是通過密度原理進行檢測[1]，需要對樣品進行蒸餾處理，操作過程復雜，所需樣品量相對較大，且測量結果不夠準確，容易受溫度以及糖等可溶性物質的影響。

目前，對于各種有機成分的快速、精確定量，往往習慣使用氣相色譜或液相色譜。盡管有很多文獻報道了采用氣相、液相色譜對酒精發酵醪中多種有機成分的分析[2～4]，然而目前采用色譜法對其中乙醇成分進行定量檢測的方法報道卻非常少。僅有的幾篇報道[5～9]，主要面向的樣品通常為酒精飲料和醇基燃料。一些最新的文獻以及國標[5,6]多采用氣相色譜法，該類方法固然精確，但往往需要高純氮氣作為載氣，運行成本偏高，不適合工業上酒精發酵醪的常規檢測需求。另幾項液相色譜檢測法的文獻中[7～9]，在原料基質相對簡單的情況下，前處理過程都不夠快捷和簡便，且所用流動相往往為丙酮甚至乙腈等有機溶劑與水的混合物，運行、管理成本同樣較高，也不符合綠色、環保的發展需求。

針對以上情況，本文通過對比選用了ShodexRSpak KC-811色譜柱，采用高效液相色譜，基于稀硫酸水溶液作為流動相，建立一種前處理簡單、分析過程快速、分析結果精確可靠的乙醇定量檢測方法。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

乙醇發酵液：青島蔚藍生物股份有限公司2019年2～12月采用釀酒酵母發酵所得的11批乙醇發酵液。分析用水，自制純凈水；硫酸：優級純，國藥試劑有限公司；乙腈：色譜純，Merck公司；乙醇：色譜級(≥99.8%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2.2 儀器

美國Waters公司生產的e2695高效液相色譜儀，主要包括四元梯度泵、2414示差折光檢測器、柱溫箱等。

2.3 樣品前處理方法

取樣品溶液適量，用水進行適當的稀釋(稀釋后乙醇含量大約為3 g/L)，12000 r/min離心5 min，用0.22 μm水系濾膜過濾。

2.4 色譜分析條件

2.4.1 色譜條件A

色譜柱：ShodexRSpak KC-811色譜柱；流動相：5 mmol/L硫酸溶液；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：示差檢測器，檢測器溫度35 ℃。

2.4.2 色譜條件B

色譜柱：ShodexRSpak KC-811色譜柱；流動相：乙腈：水=75∶25(V∶V)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：示差檢測器，檢測器溫度35 ℃。

2.4.3 色譜條件C

色譜柱：Waters suger-I色譜柱；流動相：50 mg/L EDTA-鈣溶液；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；柱溫90 ℃，檢測器：示差檢測器，檢測器溫度35 ℃。

3 結果與討論

3.1 檢測方法的對比

實驗中首先選取了兩種常見的陽離子色譜柱Waters Sugar-Pak I和ShodexRSpak KC-811，分別采用色譜條件C和色譜條件A進行了乙醇含量測定可行性探索，具體結果見圖1。

圖1 不同色譜柱的色譜

如圖1所示，Waters Sugar-Pak I的乙醇保留時間(24 min)比ShodexRSpak KC-811(15min)長9 min，峰形較寬，且有一定程度的拖尾。從柱溫條件上看，Waters Sugar-Pak I為90 ℃，也遠高于ShodexRSpak KC-811的30 ℃。因此，從色譜結果和實驗便捷角度考慮，決定選擇ShodexRSpak KC-811作為建立相應乙醇含量測定方法的色譜柱。

確定選用ShodexRSpak KC-811色譜柱后，進一步實驗選擇較優的流動相，以獲得更好的檢測條件。實驗采用3 g/L樣品進行檢測，對比了色譜條件B(以乙腈∶水=75∶25(V∶V)為流動相)和色譜條件A(以5 mmol/L硫酸溶液為流動相)的乙醇檢測效果，具體結果如圖2所示。

圖2的結果顯示，在其余條件均相同的情況下，以乙腈-水溶液作為流動相時，保留時間較稀硫酸水溶液縮短3min左右。然而，在化學分析相關領域廣為人知的是，乙腈除了是非常好的流動相選擇之外，同時其本身還是一種毒性揮發物[10]，操作危險性較高，使用后還需要較復雜的無害化處理。在綠色檢測正逐漸成為業內共識的今天，采用乙醇、過熱水、離子液體等替代乙腈的綠色液相色譜方案非常多見[9,11～15]，但卻很少看到采用常溫水溶液的方案。

圖2 不同流動相的色譜

本研究用稀硫酸水溶液替代乙腈-水溶液作為流動相，除響應時間稍長于傳統方案，其他各項性能甚至會優于傳統方案。比如，從峰形上看，以硫酸溶液為流動相時，峰形相對更好。從峰面積上看，以硫酸溶液為流動相時，乙醇色譜峰(峰2)的峰面積為78719 μV·s，而以乙腈-水溶液為流動相時，乙醇色譜峰(峰1)的峰面積為48969 μV·s，結果表明在樣品濃度相同的情況下，以硫酸溶液為流動相時響應值更高。因此，從色譜結果和環保角度考慮，本實驗選擇綠色液相色譜方案(條件A)用于乙醇含量的測定。

與文獻[7～9]選擇丙酮+水為流動相等相比，本實驗選擇5 mmol/L稀硫酸水溶液為流動相更綠色環保，不需要對后期廢液進行特殊處理。綜上所述，本實驗選擇ShodexRSpak KC-811色譜柱，采用色譜條件A進行乙醇含量測定方法的建立，并進行方法學考察。

3.2 方法學考察

3.2.1 線性關系考察

配制100 g/L的乙醇溶液，進行不同倍數的稀釋，在規定的色譜條件下進行測定，做峰面積-乙醇含量的線性關系。如圖3所示，采用規定的方法對乙醇進行含量測定時，其濃度在0.6～6 g/L范圍內線性良好，R2可達0.9999以上。

圖3 乙醇線性關系

本實驗以信噪比(S/N)=3對應的含量作為檢出限，通過對樣品色譜圖基線的分析，發現該方法下乙醇的檢出限為11.67 mg/L。以信噪比(S/N)=10對應的含量作為定量限，可得出乙醇定量限為40.85 mg/L。

3.2.2 精密度試驗

取乙醇對照品溶液，在規定的色譜條件下連續進樣6 次，測定峰面積。計算乙醇峰面積的RSD為0.51%，結果表明該方法的精密度良好。

3.2.3 穩定性試驗

取同一批供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h按規定的色譜條件進樣，結果乙醇峰面積的RSD為0.72%。表明供試品溶液中乙醇在24 h內穩定。

3.2.4 重復性試驗

本實驗選取5 個不同濃度的乙醇樣品，在規定的色譜條件下，連續進樣6 次，其峰面積RSD的平均值為0.6%，具體見表1。結果表明，所選方法在測定樣品中乙醇濃度的重復性良好。

表1 乙醇重復性實驗

3.2.5 加標回收率試驗

取已知乙醇含量的樣品9 份，加入3 種不同濃度水平的乙醇標準溶液，進行加標回收率試驗(n=3)，具體結果見表2。結果表明，該方法的平均加標回收率為96.66%，回收率的RSD為1.3%，說明回收率良好，適合于本樣品的含量測定。

表2 乙醇加標回收率實驗

3.3 樣品含量測定

檢測方法建立后，對檢測方法的性能進行確認，以保證建立的檢測方法適用樣品的檢測。本實驗分別對10批乙醇發酵醪樣品(2019年2～12月)進行了的5次平行測定，結果如表3所示，其酒精含量測定值的RSD最高為3.06%，小于5%，符合定量檢測方法要求。

表3 樣品含量測定

4 結論

本文基于色譜柱、流動相的選擇和優化，建立了高效液相色譜法測定乙醇發酵液中乙醇含量的方法。前處理僅采用去離子水對樣品稀釋，然后用0.22 μm水系濾膜過濾即可上樣。具體色譜條件為，色譜柱為ShodexRSpak KC-811色譜柱；流動相為5 mmol/L硫酸溶液；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測器為示差檢測器，檢測器溫度為35 ℃。

試驗進一步確定和驗證了該方法的線性范圍、重復性、加標回收率等。結果表明，該分析方法在乙醇濃度0.6～6.0 g/L范圍內線性度良好，R2=1；檢出限為11.67 mg/L；定量限為40.85 mg/L；加標回收率為96.66%，樣品重復性(RSD)小于1.0%。發酵醪的分析結果顯示，其酒精含量測定值RSD最高為3.06%。與現有文獻的充分對比顯示：該方法樣品處理簡單，對乙醇含量的測定快速、準確、可靠，值得乙醇發酵領域檢測乙醇濃度時借鑒使用。