綠原酸合成代謝途徑關鍵酶的生物信息學研究

馮唐鍇，楊文濤

(景德鎮學院 生物與環境工程學院，江西 景德鎮 333000)

1 引言

金銀花(Lonicerajaponica)為忍冬科忍冬屬多年生半常綠木質藤本植物，通常可分為六大類。現存忍冬屬植物200余種，我國約98種，其中47種可入藥 ，如山銀花等[1～3]。金銀花藥用成分包括黃酮類化合物、揮發油、三萜皂苷類化合物、無機元素類、有機酸類化合物等[4,5]，其中的綠原酸等化合物[6,7]都具有清熱解毒、涼散風熱功效[8]，還能抗菌、抗病毒、抗炎、促進炎性細胞吞噬功能、降血脂、使中樞神經興奮，甚至對肉瘤S180和艾式腹水癌也有明顯的細胞毒作用[9～11]。金銀花起到藥用功效的主要化合物為綠原酸[12～15]；目前對金銀花各類藥用成分合成途徑的研究中，也屬綠原酸最為詳細[16～18]；通過各種手段影響代謝途徑，提高金銀花綠原酸的含量也是研究的熱點[19]。因此，本研究以金銀花綠原酸合成代謝途徑為主要研究背景，利用生物信息學方法對植物綠原酸合成的3種關鍵酶進行了比較分析。希望通過此研究了解各類植物中綠原酸合成關鍵酶的理化性質和進化關系，為進一步深入研究綠原酸合成途徑提供線索和參考。

2 材料與方法

本研究通過查閱文獻資料了解綠原酸合成途徑及其關鍵酶。從美國國家生物信息中心(National center for biotechnology information，NCBI，網址：www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取各種酶的氨基酸序列。利用ExPASy-ProtParam(網址：expasy.org/protparam/)在線軟件了解金銀花合成途徑關鍵酶的理化性質。利用MEGA-7軟件比對各植物同種酶蛋白氨基酸序列間的相似性及演化距離、構建系統發生樹。研究于2019年9月份至2020年5月份在景德鎮學院生物與環境工程學院生物化學實驗室進行。

3 結果與分析

閱讀文獻資料[20～22]表明，綠原酸合成途徑中羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶(Hqt)、羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸/莽草酸羥基肉桂酰轉移酶(Hct)和P-香豆酸3-羥化酶(C3h)均起著很重要的作用，是該途徑的關鍵酶。本研究對不同植物中的這3種酶分子進行了序列檢索、理化性質分析和相似性比對及建樹。

3.1 序列檢索及理化性質分析

3.1.1 羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸 羥基肉桂酰轉移酶(Hqt)

Hqt在植物中的表達量及分布都與綠原酸含量正相關，且該酶還能在體外催化奎寧酸與咖啡酰輔酶A的縮合反應[23～25]。本研究下載了10種植物的Hqt氨基酸序列信息，利用在線軟件ExPASy-ProtParam逐一分析比較目標酶蛋白的理化性質，所得結果如表1所示。

表1 不同植物Hqt的序列號及理化性質

分析結果表明，10種不同植物的Hqt約含400～500 個氨基酸殘基；相對分子質量約為47.0～50.0 kDa。等電點(pI)變化分布在5.48～7.64之間，總體為中性偏酸分布。分析結果表明不同植物Hqt穩定性有差異，金銀花、桔梗、刺苞菜薊中的該酶穩定性相對較強，其他6種植物該酶穩定性較弱。相對平均親水性分析表明該酶為親水性蛋白，只有在虎眼萬年青中該酶表現為疏水。

3.1.2 羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸/莽草酸 羥基肉桂
酰轉移酶(Hct)

下載了10 種植物Hct氨基酸序列信息，利用ExPASy-ProtParam在線軟件分析比較目標酶蛋白理化性質，所得結果如表2所示。

表2 不同植物Hct的序列號及理化性質

分析結果表明，10種不同植物的Hct約含400～500 個氨基酸殘基；相對分子質量約為44.0～50.0 kDa。等電點(pI)變化分布為5.44～6.76，皆為等電點弱偏酸性分子。不同植物Hct穩定性也存在差異，金銀花、煙草、桔梗、團花樹、紫錐菊、木槿中該酶穩定性相對較強，其他4種植物該酶穩定性較弱。所有10種植物的Hct均為親水性蛋白。

3.1.3 P-香豆酸3-羥化酶(C3h)

下載了10種植物C3h氨基酸序列信息，利用ExPASy-ProtParam在線軟件分析比較了目標酶蛋白理化性質，所得結果如表3所示。

表3 不同植物的C3h的序列號及理化性質

分析結果表明，10 種不同植物的C3h約含400～500 個氨基酸殘基，相對分子質量約為44.0～60.0 kDa。等電點(pI)方面，金銀花C3h較為特殊，為堿性較強的8.92，其他9種C3h分子等電點均為弱酸性值，分布在5.42～6.76之間。金銀花、芝麻、西樺、苦蕎、水仙、毛白楊C3h分子較為穩定，其他4種植物的該分子穩定性較弱。所有10種植物的C3h皆為親水性蛋白。

3.2 系統發生分析

3.2.1 羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸 羥基肉桂酰轉移酶(Hqt)

本研究利用MEGA-7軟件對表1中所列不同植物的Hqt氨基酸序列進行比對，利用距離標尺、分支長度、自展值等指標分析了Hqt分子的進化關系，并構建了系統發生樹(圖1)。由圖1可知，金銀花與桔梗的Hqt親緣關系最近，其次是刺苞菜薊，三者的分支長度接近，遺傳距離相近，這與它們的穩定性分析結果也較為吻合，可能表明它們在綠原酸的生物合成途徑中的作用相似度更高。系統發生樹還顯示虎眼萬年青Hqt與其余9種植物Hqt親緣關系較遠，這一結果與親水性分析結果吻合，可能提示虎眼萬年青中的Hqt的結構、功能及其參與的主要代謝途徑等方面與其他9種植物存在差異。

圖1 10種植物Hqt的親緣分析

3.2.2 羥基肉桂酰輔酶A:奎寧酸/莽草酸 羥基肉桂
酰轉移酶(Hct)

利用MEGA-7軟件對表2中10種植物的Hct氨基酸序列進行比對分析，構建系統發生樹。由圖2可知，金銀花與煙草的Hct親緣關系較為接近，表明它們在綠原酸合成途徑中作用可能相近，因此研究該代謝途徑時可以對金銀花和煙草進行比較[26]。

圖2 10種植物Hct的親緣分析

3.2.3 P-香豆酸3-羥化酶(C3h)

利用MEGA-7軟件對表3中10種植物的C3h氨基酸序列進行比對分析，構建系統發生樹。如圖3所示，金銀花C3h和其他9種植物間沒有親緣關系特別相近的分子。相對而言，它和金合歡、豇豆、毛白楊、西樺的親緣關系可能稍近一些。其他植物中金合歡和豇豆親緣關系較近，毛白楊和西樺的親緣關系較近。

圖3 10種植物C3h的親緣分析

4 結論

不同植物綠原酸合成途徑3種關鍵酶的理化性質分析結果表明，從氨基酸殘基數目、相對分子質量、等電點、穩定性、親水性等幾個基礎指標來看，不同生物中的同種酶相似性較高，但是具體細節方面會有一些差異。對Hqt而言，10種植物中金銀花與桔梗、刺苞菜薊的Hqt分子穩定性較高，而虎眼萬年青的Hqt與其他植物有著較為明顯的差異。在Hct方面，不同植物的酶分子只在穩定性方面存在一些差異。在C3h方面，金銀花C3h的等電點為堿性達8.92，而其他植物皆為弱酸性。氨基酸序列比較和建樹分析表明，不同植物同類酶的理化性和序列相似性分析結果是一致的。以金銀花為例：Hqt方面，金銀花和桔梗進化關系最近，其次是刺苞菜薊；與虎眼萬年青遺傳距離最遠。Hct方面，與金銀花進化關系最近的是煙草，其次是團花樹和中粒咖啡。C3h方面，則沒有發現與金銀花進化關系特別接近的植物物種。

5 討論

對金銀花等不同植物綠原酸合成途徑中Hqt、Hct、C3h的系統發生分析表明，用不同蛋白質分子建立系統發育樹不能得出各種植物相同的進化關系。如：金銀花和桔梗的Hqt分子進化關系較近，而它們的Hct的進化關系則較遠。代謝途徑相似的情況下，不同植物中合成的終產物(如：綠原酸)含量也可能有差異。因此關鍵酶的序列差異和表達差異都可能對代謝終產物的生成有所影響。不同植物不同酶分子進化上的差異，可能表明它們所在植物為了適應各自的環境和生存策略，選擇了對不同化合物的需求差異，并進一步將這種差異反映在了代謝途徑中，最終這種選擇會映射到相應的基因組中，影響到遺傳的變化。虎眼萬年青Hqt與其他植物較大的遺傳距離以及疏水性方面的明顯差異，可能表明綠原酸合成途徑對該植物而言，或者有不一樣的作用。另外，金銀花C3h與其他植物同一分子在等電點方面的顯著差異，可能指示金銀花細胞中C3h的活性環境與其他植物或有差異，但這需要通過實驗進一步證明。

本研究最大的遺憾是在選擇植物種類的時候，沒有選擇相同物種的3種關鍵酶進行比較，削弱了不同植物綠原酸合成途徑的可比性。這主要是因為并非所有目的物種的Hqt、Hct和C3h都被測序研究，或者并非所有的植物都有完整的綠原酸合成途徑。因此，如果要有更準確的分析結果，可能還需要進一步改進研究策略，例如：3種綠原酸合成途徑的關鍵酶在金銀花和煙草中都存在，且兩種植物的Hct的分子遺傳距離很近。因此在后續代謝途徑比較研究過程中可以將金銀花和煙草進行對比，幫助人們進一步了解了綠原酸合成途徑的細節。