細黃鏈霉菌產纖維素酶的研究

摘要：以本實驗室篩選保藏的產纖維素酶的細黃鏈霉菌作為出發菌株，對不同初始pH、不同碳源、不同氮源對纖維素酶的影響進行了研究。結果表明，細黃鏈霉菌產纖維素酶最高時的最適初始pH為7.2、最適碳源為1%羧甲基纖維素鈉和0.3%糖蜜、最適氮源為0.3% 硫酸銨和0.3%酵母浸膏，在此條件下纖維素酶的活力能達到8.10U/毫升。為今后將細黃鏈霉菌更好地開發成農用微生態制劑奠定基礎。

關鍵詞：細黃鏈霉菌；纖維素酶；農用

近年來，隨著社會經濟的快速發展和人口的迅猛增長，人們對糧食數量和質量的要求也越來越高，農業有機廢棄物也隨之大量產生。目前，我國有機廢棄物的總排放量達到41.3～43.3×108噸/年。在大量生成的農業廢棄物中，從有機質養分資源來講，占首位的是農作物的秸稈。

農作物秸稈是農業生產中產生的廢棄物，據統計，我國每年秸稈資源產出量約為10億噸。纖維素作為農作物秸稈的主要成分，利用微生物對其進行降解，能夠生成可被植物吸收利用的肥料，提高秸稈利用率的同時能夠很大程度地緩解環境污染，這已成為近年來的研究熱點。利于微生物降解纖維素已經取得了一定的成果。

能分解纖維素的菌通常可分為細菌、放線菌和真菌三大類。細菌以枯草芽孢桿菌為主，但是細菌產生的纖維素酶大多為內切酶，不易分泌到胞外，并且纖維素酶活性較低。放線菌和真菌等真核微生物所分泌的纖維素酶主要是胞外酶，—般對纖維素的降解效果好并且酶活力較高。

目前國內對放線菌產纖維素酶的相關研究較少，本研究從實驗室所保存的細黃鏈霉菌中選擇產纖維素酶能力較高的菌株，作為出發菌株，通過發酵工藝優化對產酶情況的影響進行了研究，為其在實際中的應用提供了依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

Streptomyces？microflavus002由微生物肥料技術研究推廣中心分離保藏。？

1.2 培養基

（1）纖維分解鑒定培養基：剛果紅纖維素培養基。

（2）種子培養基：高氏一號培養基：可溶性淀粉2%，KNO3？0.1%，K2HPO4？0.05？%，MgSO4？0.05%，FeSO4？0.001%，NaCl？0.05？%，pH7.0～7.4。

（3）液體發酵培養基：KH2PO4？0.5克，MgSO4·7H2O？ 0.25克，明膠2克，羧甲基纖維素2克，蒸餾水1000毫升，pH7.2。

（4）發酵產酶培養基：CMC？ 10.0克，糖蜜3.0克，酵母浸膏3.0克，（NH4）2SO4？3.0克，KH2PO4？2.0克，MgSO4·7H2O？ 0.5克，pH7.2，蒸餾水1000毫升。

1.3 試驗方法

種子培養：將實驗室保存的細黃鏈霉菌在剛果紅纖維素鑒定培養基進行分離，29℃溫度下培養3～5天。選取透明圈較大的菌株進行培養。

將上面篩選出的菌種接種至高氏一號種子培養液（裝液量100毫升的500毫升三角瓶），29℃、200轉/分鐘振蕩培養36小時。

發酵培養：將培養好的種子液按10%接種量接入發酵培養基？（裝液量200毫升的1000毫升三角瓶），30℃、200轉/分鐘發酵培養96小時。

菌株酶活的測定：

粗酶液的制備，取適量培養液，4℃、8000轉/分鐘離心10分鐘，上清即為粗酶液。

酶活力的測定，取粗酶液，加入含有50毫克羧甲基纖維素納（CMC）或50毫克濾紙、并且pH為4.4的緩沖液中，55℃保溫l小時或20分鐘，之后再加入二硝基水楊酸（DNS），置于沸水中保溫顯色10分鐘后，冷卻至室溫，用分光光度計于波長為？550納米下測其OD值，根據所得標準曲線，將每分鐘產生1微摩爾的葡萄糖定義為一個酶活單位，以U表示。

發酵工藝優化：

pH對纖維素酶活力的影響。將培養基初始pH調至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接種后于29℃、200轉/分鐘下振蕩培養96小時，測定發酵液中纖維素酶的酶活。

碳源對纖維素酶活力的影響。將培養好的種子液接種于不同碳源的培養基中進行發酵培養，測定細黃鏈霉菌發酵液中纖維素酶的酶活。

氮源對纖維素酶活力的影響。將培養好的種子液接種于不同氮源的培養基中進行發酵培養，測定細黃鏈霉菌發酵液中纖維素酶的酶活。

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶的細黃鏈霉菌的培養

菌株在經剛果紅培養基分離培養，選擇在剛果紅培養基上的透明圈較大的細黃鏈霉菌作為產纖維素酶試驗菌株。

2.2 纖維素酶活力的測定

根據1.3的方法測定纖維素酶的活力，其結果見圖1、圖2、？圖3。

以pH為橫坐標、纖維素酶活力為縱坐標作曲線。結果如圖1所示，結果表明，初始pH為7.2時，細黃鏈霉菌產纖維素酶的活力最高，達到6.68U/毫升，pH為7.0次之，隨著初始pH的升高酶活下降。

本試驗在以1%的硫酸銨為氮源的前提下，對幾種常見碳源下產生的纖維素酶的活力進行了比較，結果如圖2所示。結果表明，不同碳源對酶活的影響較大。當羧甲基纖維素鈉（CMC）和糖蜜作碳源時，發酵培養第5天產纖維素酶的活力最高，可能因為糖蜜中含有某種微量元素利于菌體纖維素酶的產生；發酵培養第4天，CMC和葡萄糖作碳源下產纖維素酶的活力最高，可能是因為葡萄糖為速效碳源，前期利于菌體的快速生長和纖維素酶的分泌；CMC作為碳源時，纖維素酶的活力最低。因此本試驗中細黃鏈霉菌產纖維素酶的最佳碳源為CMC和糖蜜。

在可溶性淀粉和糖蜜為碳源的情況下，對幾種常見氮源下所產生的纖維素酶的酶活進行了比較，結果如圖3所示。結果表明，不同氮源對纖維素酶酶活的影響較大。當硫酸銨和酵母浸膏作氮源時，產纖維素酶的活力最高，可能因為酵母浸膏中含有某種微量元素利于菌體纖維素酶的產生；而硫酸銨、豆餅粉等作為氮源時，產纖維素酶的活力相對較低。因此本研究中細黃鏈霉菌產纖維素酶的最佳氮源為硫酸銨和酵母浸膏。

3 結論與討論

實驗結果表明，細黃鏈霉菌酶活較高的最適初始pH為7.2、最適碳源為1%的CMC和0.3%？糖蜜、最適氮源為0.3%？硫酸銨和0.3%？酵母浸膏，在此條件下發酵培養5天，纖維素酶的活力能達到8.10U/毫升。

本試驗從初始pH、碳源、氮源3個方面對細黃鏈霉菌產纖維素酶的情況進行了研究，為今后利用細黃鏈霉菌生產纖維素酶提供了相關理論依據。由于細黃鏈霉菌產纖維素酶的活性較低，并且影響酶產生及酶活力的因素較多。因此篩選得到的試驗菌株細黃鏈霉菌的產酶條件有待進一步優化。

作者簡介：申術霞（1989-），女，碩士研究生，中級工程師。主要從事微生物發酵及代謝產物的研究。