低分子量褐藻多糖硫酸酯對小鼠動脈粥樣硬化影響

[摘要] 目的 探討低分子量褐藻多糖硫酸酯（LMWF）對小鼠動脈粥樣硬化（AS）作用。方法 選擇ApoE（-/-）雄性小鼠40只，隨機分為對照組、模型組、陽性對照組和治療組，每組10只。模型組、陽性對照組和治療組應用高脂飼料喂養，對照組應用普通飼料喂養。陽性對照組和治療組小鼠分別給予普羅布考和LMWF 0.5 mL灌胃干預治療，對照組和模型組小鼠同步給予體積分數0.02橄欖油0.5 mL灌胃。采用生物化學方法檢測小鼠血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，油紅O染色和蘇木精-伊紅染色方法檢測動脈內膜粥樣硬化斑塊的面積和結構，TUNEL法檢測動脈內膜細胞凋亡情況。結果 與對照組比較，模型組小鼠血清TG、TC、LDL-C和ox-LDL水平顯著升高，而HDL-C顯著降低（F=21.98～114.31，Plt;0.05）;與模型組比較，陽性對照組和治療組小鼠血清TG、TC、LDL和ox-LDL水平顯著降低，HDL水平顯著升高（Plt;0.05）;治療組小鼠TG、TC、LDL-C和ox-LDL水平明顯低于陽性對照組，而HDL-C水平明顯高于陽性對照組（Plt;0.05）。治療組小鼠動脈粥樣斑塊的面積較模型組顯著縮小（F=595.39，Plt;0.01），動脈內膜結構顯著改善（F=122.16，Plt;0.05），動脈內膜的細胞凋亡程度顯著降低（F=8 128.51，Plt;0.01）。結論 LMWF能調控ApoE（-/-）小鼠體內脂質代謝紊亂，抑制粥樣硬化斑塊的形成，減緩AS的發展。

[關鍵詞] 動脈粥樣硬化;褐藻多糖硫酸酯;膽固醇，LDL;細胞凋亡;小鼠

[中圖分類號] R282.72

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）01-0068-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.028

動脈粥樣硬化（AS）是心腦血管疾病的病理學基礎[1]，AS發生發展涉及大量炎性細胞和細胞因子[2]，炎性細胞和細胞因子促進了斑塊的形成[3]。低密度脂蛋白（LDL）滯留在血管內膜下是AS的主要病理機制，富含膽固醇的載脂蛋白聚糖上的糖胺聚糖能夠通過LDL激活免疫應答啟動炎癥級聯反應[4]。脂質氧化作用可以導致具有生物活性的脂類釋放，其中的LDL顆粒可以被修飾成為氧化LDL（ox-LDL）[5]，引起內皮細胞功能紊亂、炎性因子的釋放，促進血管平滑肌細胞（VSMC）遷移和泡沫細胞的形成，最終形成AS斑塊[6]。研究證實，心血管疾病病人血漿ox-LDL水平明顯升高，活性氧（ROS）的產生能夠導致LDL的氧化，而ox-LDL又能促進內皮細胞、VSMC和巨噬細胞中ROS的形成[7-8]。褐藻中提取的天然產物褐藻多糖硫酸酯，尤其是低分子量褐藻多糖硫酸酯（LMWF）具有眾多高效的生物活性[9]，其對內皮細胞和巨噬細胞有一定的調控作用[10]。本文研究LMWF對高脂飲食誘導的ApoE（-/-）小鼠[11]血脂代謝和AS斑塊形成的影響，探討LMWF是否有抗AS的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海藻提取物LMWF樣品由中國科學院海洋研究所張全斌研究員提供，主要成分為高度硫酸化的α-L-巖藻糖和D-半乳糖及少量D-甘露糖、D-木糖、D-鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖和糖醛酸[9]。SPF級7周齡ApoE（-/-）雄性小鼠40只，體質量為20～24 g，北京華阜康生物科技有限公司提供，飼養于青島大學動物實驗中心，室溫（22±2）℃、濕度（60±5）%，12 h /12 h明暗周期，自由飲食。標準高脂塊狀飼料，每100.00 g含脂肪21.00 g、膽固醇0.15 g。

1.2 實驗方法

ApoE（-/-）小鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照組（A組）、模型組（B組）、陽性對照組（C組）和治療組（D組），每組10只。對照組：小鼠普通飼料喂養，0.5 mL橄欖油（體積分數0.02）灌胃給藥;治療組：高脂飼料喂養，200 mg/kg LMWF（用體積分數0.02橄欖油溶解至0.5 mL）溶液灌胃;陽性對照組：高脂飼料喂養，200 mg/kg普羅布考（Probucol，用體積分數0.02橄欖油溶解至0.5 mL）溶液灌胃給藥;模型組：高脂飼料喂養，體積分數0.02橄欖油0.5 mL灌胃。各組給藥均隔日1次，連續16周。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 血脂檢測 給藥結束后第2天，100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，經心臟取血1 mL，生化采血管收集，靜置3 h，以4 000 r/min離心10 min，分離血清。全自動生化分析儀（AU 5800，貝克曼庫爾特有限公司）檢測血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.3.2 血清ox-LDL檢測 應用ox-LDL ELISA試劑盒（Bio-Maide公司）檢測，按說明書操作。每個樣品孔先加40 μL樣品稀釋液，后加10 μL樣品。每孔加50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，于37 ℃避光靜置15 min。終止顯色反應。以空白孔調零，Spectramax M5多功能酶標儀測定450 nm波長處各孔吸光度，制作標準曲線，計算ox-LDL濃度。

1.3.3 AS粥樣斑塊面積檢測 用油紅O染色方法。經心臟取血后，每組隨機取小鼠5只，分別切取主動脈1 cm，縱行剖開展平，置于40 g/L多聚甲醛固定2 h，流水沖洗，油紅O染色5 min，體積分數0.60異丙醇分化5 s，蘇木精復染2 min。甘油明膠封固。光鏡下觀察AS斑塊位置，計算斑塊面積。

1.3.4 AS粥樣斑塊病理結構觀察 采用蘇木精-伊紅（HE）染色方法。經心臟取血后，每組取剩余小鼠5只，分別切取主動脈1 cm，置40 g/L多聚甲醛固定2 h，流水沖洗后用OCT包埋，液氮速凍。冷凍切片機（HM 505E，德國美康有限公司）連續切片，厚度10 μm，貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上。蘇木精染色5 min，鹽酸乙醇分化5 s，伊紅染色90 s。常規脫水、透明、封片。光鏡下觀察，粥樣斑塊呈紅褐色，觀察AS斑塊位置并計算斑塊面積。

1.3.5 細胞凋亡檢測 采用In Situ細胞凋亡試劑盒（羅氏有限公司）檢測，按說明書方法操作。熒光顯微鏡（Olympus BX53，Japan）下450～500 nm波長處觀察，凋亡細胞呈綠色熒光。隨機觀察5個視野，測定吸光度值，取均值，以其表示細胞凋亡情況。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0 軟件進行統計學處理。計量資料結果以[AKx-D]±s表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK（Students-Newman-Keuls）法。以Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠血脂水平比較

各組小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較，差異有顯著性（F=21.98～114.31，Plt;0.05），其中模型組TG、TC、LDL-C水平較對照組顯著升高，而HDL-C顯著降低（Plt;0.05）;陽性對照組和治療組TG、TC和LDL-C水平較模型組均明顯降低，而HDL-C水平升高（Plt;0.05）;治療組小鼠TG、TC、LDL-C水平明顯低于陽性對照組，而HDL-C水平明顯高于陽性對照組（Plt;0.05）。各組小鼠血清ox-LDL水平比較差異有顯著性（F=111.79，Plt;0.05），其中模型組ox-LDL水平較對照組顯著升高（Plt;0.05），而治療組與陽性對照組血清ox-LDL水平較模型組均顯著降低，且治療組下降更為顯著（Plt;0.05）。見表1。

2.2 各組主動脈AS斑塊面積比較

油紅O染色顯示，對照組小鼠主動脈可見散在的橘紅色AS斑點，面積為（53±5）mm2;模型組出現明顯的大片狀AS斑塊，面積為（230±16）mm2;陽性對照組的AS斑塊呈現條紋狀，面積為（116±10）mm2;治療組小鼠的AS斑塊呈散點狀，面積為（75±6）mm2。各組AS斑塊面積比較，差異有顯著性（F=595.39，Plt;0.01），其中治療組與陽性對照組小鼠斑塊面積均較模型組減小（Plt;0.05），且治療組減小更為顯著（Plt;0.05）。見圖1。

2.3 各組主動脈病理結構比較

HE染色顯示，對照組小鼠主動脈內膜光滑，未見明顯的病理改變;模型組小鼠主動脈內膜增厚、粗糙，出現明顯的紅褐色AS斑塊，斑塊面積為（165±25）μm2;治療組主動脈內膜變薄，斑塊面積為（68±5）μm2;陽性對照組主動脈內膜斑塊面積為（93±11）μm2。治療組、陽性對照組主動脈內膜粥樣斑塊面積與模型組比較均顯著性減小（F=122.16，Plt;0.05），尤其是治療組動脈內膜相對光滑，粥樣硬化斑塊面積顯著低于陽性對照組（Plt;0.01）。見圖2。

2.4 各組主動脈內膜細胞凋亡比較

熒光顯微鏡下觀察，對照組小鼠主動脈內膜光滑;模型組小鼠主動脈內膜凹凸不平，出現凋亡細胞，血管壁內膜處細胞凋亡尤為明顯;治療組與陽性對照組小鼠動脈壁的細胞凋亡熒光強度顯著減弱。對照組吸光度值為105±7，模型組為760±85，治療組為150±12，陽性對照組為170±16，4組吸光度值比較差異有統計學意義（F=8 128.51，Plt;0.01），其中任意兩組比較差異均具有統計學意義（Plt;0.05）。見圖3。

3 討 論

目前研究普遍認為，AS是由遺傳和環境等多種危險因素共同作用引起的疾病，高脂血癥、高血壓、肥胖、吸煙、年齡和糖尿病等是AS的傳統危險因素[12]。起初人們對AS的認識只限于AS是脂質堆積造成的動脈管壁堵塞而已，但近年實驗研究和臨床試驗證明，炎癥反應在AS及其并發癥中發揮重要作用。目前有多種學說從不同角度探討了AS的發生機制和病理過程，例如炎癥學說、氧化應激學說、脂質滲入學說、平滑肌突變學說和內皮損傷學說等[13-15]。AS發生的起始階段，主動脈、冠狀動脈和腦動脈等大動脈部位脂質堆積并持續增加，其分支點和彎曲區極易形成AS斑塊，循環的脂蛋白顆粒浸潤至這些區域的動脈管壁，干擾局部內皮細胞正常功能，導致脂質及炎癥因子在動脈內膜堆積，促進了AS斑塊的產生[16]。AS斑塊一旦破裂，會引起一系列急性臨床疾病的發生，如腦卒中和急性心肌梗死等，導致病人癱瘓或者死亡。

AS是心腦血管疾病的病理學基礎，其發生發展涉及大量炎性細胞和細胞因子。在AS早期，內皮功能障礙和脂質代謝紊亂會導致內皮細胞活化和細胞通透性的改變[4]。TG、TC、LDL-C和HDL-C是AS主要的臨床生化評價指標，在AS的發生發展過程中具有關鍵作用[7]。ApoE（-/-）純合子小鼠是被公認的一種AS血管損傷模型，具有形成AS的基礎，經高脂飼料喂養一定時間后，就會出現典型的AS癥狀體征、血生化及血管病理改變[17]。本研究應用高脂飼料喂養ApoE（-/-）小鼠，結果顯示，模型組小鼠血清TG、TC和LDL-C水平較對照組均顯著升高，而HDL-C水平則顯著降低，說明AS動物模型構建是成功的;治療組TG、TC和LDL-C水平較模型組均明顯降低，而HDL-C水平升高;治療組小鼠TG、TC、LDL-C水平明顯低于陽性對照組，而HDL-C水平明顯高于陽性對照組，說明LMWF具有與普羅布考同樣的降脂作用，且LMWF的降脂作用更為明顯。

在AS的發生發展過程中，內皮細胞通透性改變，ox-LDL積累在內皮細胞下，刺激單核細胞分化為巨噬細胞，進而導致平滑肌細胞增生和遷移、血小板聚集、白細胞黏附和炎癥細胞因子的釋放等變化，促進了AS發生發展過程[18]。其中，巨噬細胞吞噬過量產生的ox-LDL形成泡沫細胞，泡沫細胞以壞死核為中心沉積在壞死核周圍形成脂紋，最終發展為AS斑塊[19]。LMWF具有多種生物學活性如抗氧化、抗炎性、抗血栓以及保護內皮細胞功能等[20]。本研究油紅O染色和HE染色結果均表明，模型組小鼠形成了明顯的AS斑塊;與模型組比較，治療組AS斑塊面積減少，說明LMWF對AS小鼠主動脈的損傷有明顯的抑制和改善作用，以此減緩AS的發生發展。提示LMWF可能通過抗氧化作用抑制AS的發生和發展。

游離的TG、TC、LDL-C和ox-LDL是強促炎性刺激因子，可引起更多巨噬細胞的聚集，脂質（TG和TC）、巨噬細胞、平滑肌細胞、細胞外基質、鈣和壞死碎片構成了AS斑塊的主要成分[21]。LMWF能夠調節脂質代謝過程，抑制血管平滑肌細胞的遷移和內膜增生，減弱內皮細胞介導的血管生成過程而防治AS斑塊的形成[22]。本文的研究結果顯示，LMWF與傳統降脂藥物普羅布考的作用相似，能夠降低血清TG、TC、LDL-C和ox-LDL水平，提高HDL-C的水平，而且治療組小鼠TG、TC、LDL-C水平顯著低于陽性對照組，HDL-C水平顯著高于陽性對照組，提示LMWF可作為潛在的降脂藥物。細胞凋亡可導致內皮細胞死亡和巨噬細胞浸潤，凋亡的巨噬細胞會促進脂紋的產生，最后形成AS斑塊[23-24]。本研究結果顯示，LMWF還能明顯抑制ApoE（-/-）小鼠動脈壁內膜的細胞凋亡，減少巨噬細胞的浸潤，減緩AS的發展。

綜上所述，LMWF能調控ApoE（-/-）小鼠體內脂質代謝紊亂，通過抗氧化機制，抑制細胞凋亡和粥樣硬化斑塊的形成，減緩AS的發展。

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（本文編輯 黃建鄉）