RNA測序分析OCT4誘導人毛囊間充質(zhì)干細胞去分化的作用機制

[摘要] 目的 檢測轉(zhuǎn)導Octamer轉(zhuǎn)錄因子4（OCT4）的人毛囊間充質(zhì)干細胞（hHFMSC）衍生的貼壁和懸浮亞群轉(zhuǎn)錄組去分化差異，探討OCT4誘導hHFMSC去分化的作用機制以及去分化程度對細胞形態(tài)及黏附性的影響。方法 收集hHFMSC、貼壁亞群和懸浮亞群3組細胞并提取總RNA，進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析差異基因的組織特異性生物功能，并檢測組織特異性基因的表達變化。結(jié)果 OCT4轉(zhuǎn)導后hHFMSC中下調(diào)基因顯著富集于毛囊、表皮及皮膚附屬器發(fā)育的生物過程，且毛囊發(fā)育、皮膚分化相關基因（MYSM1、KRT15及RBPJ等）顯著下調(diào);與貼壁亞群相比，懸浮亞群中MYSM1及FZD6等毛囊發(fā)育基因進一步下調(diào)。結(jié)論 過表達OCT4可能通過調(diào)控毛囊、表皮及皮膚附屬器發(fā)育基因的表達誘導hHFMSC去分化，且細胞形態(tài)及黏附性可能與組織特異性基因表達譜有關。

[關鍵詞] 八聚體轉(zhuǎn)錄因子3;間質(zhì)干細胞;毛囊;細胞重新編程;細胞去分化

[中圖分類號] R329.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）01-0019-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.036

利用基因工程技術(shù)重編程成體細胞向特定譜系細胞分化是近年來再生醫(yī)學領域的研究熱點，單獨轉(zhuǎn)導Octamer轉(zhuǎn)錄因子4（OCT4）即可觸發(fā)體細胞的重編程[1-3]。有研究將OCT4轉(zhuǎn)導入人毛囊間充質(zhì)干細胞（hHFMSC）后細胞由長梭形變?yōu)槎噙呅危抑饾u出現(xiàn)一類小而圓的易懸浮細胞，其經(jīng)造血因子誘導可轉(zhuǎn)分化為成熟紅細胞 [4];轉(zhuǎn)錄組測序分析基因表達譜發(fā)現(xiàn)，貼壁細胞中上調(diào)基因富集于胚胎發(fā)育，懸浮細胞中上調(diào)基因富集于造血譜系分化[5]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序檢測OCT4對毛囊、表皮以及皮膚附屬器發(fā)育等組織特異性基因表達的調(diào)控作用，分析貼壁和懸浮細胞去分化程度的差異，探討OCT4對hHFMSC的去分化作用，以及去分化程度對細胞形態(tài)及黏附性的影響，為hHFMSC在再生醫(yī)學等領域廣泛應用提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)和試劑

hHFMSC為前期工作中從人毛囊真皮乳頭和真皮鞘中分離并鑒定獲得，用攜帶OCT4的慢病毒載體pLV-EF1α-OCT4-IRES-EGFP及含pVSVG、gag-pol和rev的包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞。然后再用包裝成慢病毒顆粒感染hHFMSC而獲得hHFMSCOCT4。經(jīng)傳代培養(yǎng)12 d后獲得貼壁生長細胞亞群hHFMSCOCT4-adherent，收集hHFMSCOCT4-adherent上層培養(yǎng)液，以800 r/min離心5 min，用完全培養(yǎng)液重懸獲得懸浮細胞亞群hHFMSCOCT4-floating。hHFMSCOCT4-adherent和hHFMSCOCT4-floating加含體積分數(shù)0.10的FBS、10 μg/L bFGF和100 kU/L青霉素/鏈霉素的H-DMEM/F12培養(yǎng)液，移入37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

用Trizol提取各細胞樣品總RNA，每組設3個重復樣本。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA;以mRNA短片段為模板合成cDNA，經(jīng)過純化、末端修復以及加A尾等處理后進行PCR擴增。用Agilent 2100 Bioanalyzer對構(gòu)建好的文庫進行質(zhì)檢，使用Illumina HiSeq X Ten測序儀進行測序。采用Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量預處理，并對整個質(zhì)控過程中的reads數(shù)進行統(tǒng)計匯總，htseq-count軟件獲取每個樣本中比對到蛋白編碼基因上的reads數(shù)，用cufflinks軟件計算蛋白編碼基因的表達量（FPKM值）。

1.3 差異基因（DEG）篩選及富集計算

DEG篩選條件為差異倍數(shù)（FC）>2或<-2，且P<0.05。利用DAVID數(shù)據(jù)庫分別對兩兩細胞對比的DEG進行GO功能富集分析，計算Enrichment score。Enrichment score=（m/n）/（M/N）。其中，N為所有基因中具有GO注釋的基因數(shù)目;n為DEG中具有GO注釋的基因數(shù)目;M為所有基因中注釋為某特定GO條目的基因數(shù)目;m為注釋為某特定GO條目的DEG數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計學分析

用basemean值估算各個樣本基因表達量，計算FC;負二項分布檢驗對reads數(shù)進行差異顯著性檢驗;利用超幾何分布檢驗計算GO功能中顯著富集的差異蛋白編碼基因/轉(zhuǎn)錄本列表的P值，對P值進行多重檢驗糾正后得到FDR。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEG的功能富集分析

與hHFMSC進行比較，hHFMSCOCT4-adherent中上調(diào)基因共有2 401個，下調(diào)基因共有1 882個;而hHFMSCOCT4-floating中上調(diào)基因3 107個，下調(diào)基因有2 999個。與hHFMSCOCT4-adherent相比，hHFMSCOCT4-floating中篩選出1 940個DEG，其中上調(diào)基因有833個，下調(diào)基因有1 107個。表明hHFMSCOCT4-floating與hHFMSC的轉(zhuǎn)錄本差異更為顯著，且貼壁細胞與懸浮細胞是兩種相對獨立的亞群。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對DEG的生物功能進行GO Level 2水平的富集分析，包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）。結(jié)果顯示，與hHFMSC相比，hHFMSCOCT4-adherent中DEG顯著富集于生物黏附、生物調(diào)節(jié)、細胞過程以及發(fā)育過程等生物過程，并發(fā)現(xiàn)DEG主要分布在細胞連接、細胞外基質(zhì)部分及細胞膜等細胞成分，主要具有結(jié)合、通道調(diào)節(jié)因子活性、酶調(diào)節(jié)因子活性、分子轉(zhuǎn)導活性及受體活性等分子功能（圖1）;與hHFMSC相比，hHFMSCOCT4-floating中DEG富集的生物過程主要包括生物黏附、生物調(diào)節(jié)、多器官過程和單器官過程等，DEG主要分布在細胞連接、細胞外基質(zhì)部分、大分子復合物、細胞膜等細胞成分中，并具有結(jié)合、催化活性、酶調(diào)節(jié)因子活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性及轉(zhuǎn)運活性等分子功能（圖1）。說明OCT4轉(zhuǎn)導后細胞黏附性、細胞連接組分、器官發(fā)育潛能、信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活性均發(fā)生改變，提示細胞骨架可能發(fā)生重塑，黏附生長的方式可能改變，組織特異性基因轉(zhuǎn)錄失活及多潛能性基因轉(zhuǎn)錄激活共同協(xié)調(diào)器官或組織發(fā)育潛能，從而實現(xiàn)去分化與重編程。

2.2 組織特異性基因的富集分析

本文GO分析OCT4轉(zhuǎn)導對hHFMSC中組織特異性基因表達調(diào)控情況，結(jié)果顯示，與hHFMSC相比較，hHFMSCOCT4-adherent中下調(diào)基因富集的組織特異性生物過程有12個（圖2A），包括間充質(zhì)干細胞分化、表皮細胞命運特異化、表皮發(fā)育、毛囊發(fā)育與成熟、皮脂腺發(fā)育等;hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)基因富集的組織特異性生物過程有3個，包括毛囊形態(tài)發(fā)生、毛囊發(fā)育以及毛囊發(fā)育的調(diào)節(jié)。

轉(zhuǎn)導OCT4后hHFMSC中毛囊以及皮膚組織的特異性基因表達下調(diào)，OCT4可能通過抑制組織特異性基因的表達而促使hHFMSC去分化（圖2B）。與hHFMSCOCT4-adherent相比，hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)基因顯著富集于損傷修復與表皮延伸的負調(diào)控、毛囊發(fā)育的調(diào)節(jié)以及體毛水平定向建立的生物過程（圖2C）。hHFMSCOCT4-floating的低黏附性、細胞骨架蛋白表達的改變及緊密連接通路基因的下調(diào)可能與組織特異性基因下調(diào)有關，從而失去了hHFMSC原有的細胞形態(tài)及生長方式。

2.3 毛囊、表皮及皮膚附屬器等組織特異性基因的表達情況

與hHFMSC進行比較，hHFMSCOCT4-adherent中有14個特異性基因顯著下調(diào)，其中KRT15、KRT34與表皮發(fā)育及角化相關，GLI2參與表皮細胞分化與基底細胞癌發(fā)生， COL17A1與基底膜形成有關，F(xiàn)ZD3、ALX4等與毛囊發(fā)育有關，RBPJ則在毛囊成熟、皮脂腺發(fā)育、表皮細胞命運的特異化中發(fā)揮重要作用;下調(diào)最顯著的基因為KRT15、FZD3與COL17A1，下調(diào)倍數(shù)分別為-6.92、-4.60和-5.74（圖3A）;而hHFMSCOCT4-floating中下調(diào)最顯著的特異性基因包括毛囊形態(tài)發(fā)生相關基因FOXQ1、FGF7及毛囊發(fā)育相關基因ALX4，下調(diào)倍數(shù)分別為-9.61、-6.23和-5.43（圖3B）。提示過表達OCT4后，hHFMSC中部分組織特異性基因表達下降，可能在一定程度上消除了基因組定向分化的記憶，抑制了hHFMSC毛囊及皮膚的特異性分化發(fā)育潛能，實現(xiàn)了重編程;與hHFMSCOCT4-adherent相比較，hHFMSCOCT4-floating中體毛水平定向建立的相關基因FZD6和ASTN2、表皮延伸負調(diào)控的相關基因CLASP1以及毛囊發(fā)育的相關基因MYSM1顯著下調(diào)（圖3C）。3組細胞兩兩比較均顯示MYSM1基因表達顯著下調(diào)，MYSM1基因可能是OCT4對hHFMSC發(fā)揮去分化作用的潛在靶點。

3 討 論

OCT4作為一種具有強大重編程作用的多潛能轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于胚胎干細胞（ESC）細胞核內(nèi)，在維持ESC的多潛能性和自我更新中發(fā)揮核心作用[6-8]。OCT4不僅可以維持生殖細胞和腫瘤細胞的“干性”，其異位表達還可提高骨髓間充質(zhì)細胞的“干性”[9]。細胞去分化是指細胞從高度專能性分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變到細胞重新獲得多潛能性的過程;細胞的去分化、轉(zhuǎn)分化以及重編程對于新細胞或組織的再生有重要意義[10]。重編程研究發(fā)現(xiàn)，OCT4、SOX2、KLF4和cMyc（OSKM）可將體細胞重編程為誘導性多能干細胞（iPSC），還可以將子宮內(nèi)膜息肉與宮頸息肉來源的間質(zhì)干細胞去分化成胚胎樣細胞[11]。

轉(zhuǎn)分化研究發(fā)現(xiàn)，OCT4可以促使類胚體中肝細胞向膽管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，還可在內(nèi)皮誘導體系中促使肝癌干細胞向內(nèi)皮樣細胞轉(zhuǎn)分化[12]。

毛囊是可再生的器官并且可進行自我更新[13]。hHFMSC為存在于毛發(fā)真皮乳頭和真皮鞘中的間充質(zhì)干細胞，其免疫原性低且來源廣泛，在體外經(jīng)誘導具有成骨、成軟骨、成脂肪、成神經(jīng)和成肌肉等多向分化潛能[14]。前期研究將OCT4單獨轉(zhuǎn)導入hHFMSC，經(jīng)傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)從長梭形變成多邊形，并逐漸由貼壁生長變成低黏附生長;通過轉(zhuǎn)錄組測序顯示基因表達譜發(fā)生顯著改變，且貼壁細胞與懸浮細胞具有顯著不同的轉(zhuǎn)錄本;二者多潛能性生物過程和多潛能性基因的表達亦不同，即貼壁細胞傾向于胚胎發(fā)育，而懸浮細胞獲得一定造血譜系分化潛能[6]。結(jié)合本文研究結(jié)果，OCT4轉(zhuǎn)導后下調(diào)基因顯著富集于毛囊、表皮及皮膚附屬器發(fā)育等生物過程，說明轉(zhuǎn)導OCT4使hHFMSC丟失了一部分組織特異性分化發(fā)育專能，從而實現(xiàn)去分化;由于轉(zhuǎn)導OCT4后細胞形態(tài)發(fā)生改變，推測OCT4對hHFMSC的去分化作用可能影響了細胞形態(tài)和骨架結(jié)構(gòu)，且去分化程度的差異可能導致了貼壁細胞和懸浮兩種細胞亞群的產(chǎn)生。還有研究結(jié)果證實，RhoA/ROCK通路可通過肌動蛋白細胞骨架聚合參與平滑肌的去分化[15];microRNA-138可以通過抑制F-肌動蛋白聚合導致軟骨細胞去分化[16];此外，黏著斑的組裝可誘導軟骨細胞表型改變并發(fā)生去分化，說明細胞骨架蛋白及黏附分子與細胞去分化之間關系密切[17]。

本文對DEG進一步深入分析顯示，OCT4可能通過調(diào)控KRT15、KRT34、ALX4及RBPJ等基因的下調(diào)使hHFMSC去分化，特別是毛囊發(fā)育基因MYSM1在各組細胞表達均下調(diào)，推測其可能是OCT4抑制hHFMSC組織特異性分化的潛在靶點;而懸浮細胞的類圓形形態(tài)以及低黏附性則有可能與hHFMSC更高程度的去分化狀態(tài)相對應，或許與此亞群細胞更易誘導成造血細胞有關。但去分化與細胞骨架重塑及黏附性改變之間的因果關系尚不明確，且OCT4如何調(diào)控組織特異性基因表達的具體分子途徑尚需進一步研究。

綜上所述，過表達OCT4對hHFMSC轉(zhuǎn)錄組進行了重編程，可能通過下調(diào)組織特異性基因的表達在一定程度上抑制了其向毛囊、表皮及皮膚附屬器等組織分化的專能性，從而賦予hHFMSC向造血譜系等多胚層組織及器官的分化潛能，且去分化程度及向造血譜系轉(zhuǎn)分化潛能可能與不同細胞亞群對應的組織特異性基因表達譜有關。本文結(jié)果可為hHFMSC在再生醫(yī)學領域應用提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）