心肌肥大基因差異表達(dá)及染色質(zhì)開放性的高通量測(cè)序

[摘要] 目的 運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）和染色質(zhì)開放性測(cè)序技術(shù)（ATAC-seq），探討心肌肥大發(fā)生后基因差異表達(dá)以及特征基因開放性。方法 將12只小鼠隨機(jī)分為心肌肥大組和對(duì)照組（各6只），分別腹腔注射血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和生理鹽水。應(yīng)用超聲和免疫組化方法檢測(cè)心肌肥大和纖維化程度，RNA-seq、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法檢測(cè)并驗(yàn)證基因的表達(dá)，ATAC-seq方法檢測(cè)染色質(zhì)開放性。結(jié)果 與對(duì)照組比較，心肌肥大組心肌發(fā)生肥大和纖維化。高通量測(cè)序技術(shù)獲得與心肌功能相關(guān)的差異表達(dá)基因，qPCR檢測(cè)顯示marker基因的表達(dá)量和染色質(zhì)開放水平均較對(duì)照組增高。結(jié)論 心肌肥大后，基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和染色質(zhì)開放性皆發(fā)生變化，尤其是marker基因。

[關(guān)鍵詞] 心臟擴(kuò)大;血管緊張素Ⅱ;染色質(zhì)開放性測(cè)序;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

[中圖分類號(hào)] R541

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2022）01-0001-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.029

心肌肥大是提高心肌儲(chǔ)備能力和心排血量的一種適應(yīng)性代償性反應(yīng)，病理性心肌肥大與許多心臟疾病如高血壓、冠心病等具有共同的病理過(guò)程，不可逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重危害人類健康[1-2]。目前，心肌肥大的研究涉及蛋白修飾、DNA修飾和RNA修飾等方面，但尚不夠全面[3-6]，其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究還處于起始階段。染色質(zhì)開放性測(cè)序技術(shù)（ATAC-seq）是一種在全基因組范圍內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控的利器[7]，已被廣泛應(yīng)用于研究小鼠視覺(jué)皮質(zhì)[8]、心肌梗死[9]、腫瘤[10]以及免疫系統(tǒng)[11]中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及新的調(diào)控機(jī)制。本研究使用血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）構(gòu)建心肌肥大模型，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）和ATAC-seq兩種高通量測(cè)序方法，探討全基因組內(nèi)的基因差異表達(dá)以及部分特征基因順式調(diào)控元件區(qū)域的染色質(zhì)可及性，從兩個(gè)不同層次水平上提供心肌肥大發(fā)生后的數(shù)據(jù)，以揭示影響特征基因差異表達(dá)的潛在因素，加深對(duì)驅(qū)動(dòng)心肌肥大的分子變化的認(rèn)識(shí)，為后期揭示心肌肥大基因差異表達(dá)的潛在調(diào)控機(jī)制以及更深層次信號(hào)通路和分子水平方面的研究提供數(shù)據(jù)支持。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

SPF級(jí)8周雄性C57BL/6小鼠12只，購(gòu)自青島大任富城畜牧有限公司。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組和心肌肥大組，每組6只，分別腹腔注射生理鹽水100 μL和AngⅡ（購(gòu)自EMD Millipore公司，用生理鹽水溶解，0.6 mg/（kg·d））100 μL。

1.2 超聲心動(dòng)圖檢查

腹腔注射2周后，對(duì)小鼠進(jìn)行超聲檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括室間隔舒張末厚度（IVSd）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、舒張末左室后壁厚度（LVPWd）、室間隔收縮末厚度（IVSs）、左心室收縮期內(nèi)徑（LVIDs）、收縮末左室后壁厚度（LVPWs）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、縮短分?jǐn)?shù)（FS）和心率（HR）等。

1.3 心肌細(xì)胞的大小及纖維化程度檢測(cè)

采用免疫組化方法。超聲檢查完成后，腹腔注射適量的水合氯醛（40 g/L）麻醉，斷頸處死小鼠，隨后用剪刀剪開小鼠胸腔，取出心臟，使用40 g/L多聚甲醛固定，然后分別行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色檢測(cè)心肌細(xì)胞的大小及纖維化程度。

1.4 RNA-seq檢測(cè)基因表達(dá)

取心肌組織，按照Trizol（購(gòu)自Takara公司）說(shuō)明書提取總RNA，用NanoDrop ND-1000型分光光度儀進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，然后送華大基因應(yīng)用RNA-seq方法檢測(cè)基因表達(dá)情況。

1.5 差異表達(dá)基因的篩選與分析方法

根據(jù)測(cè)序所獲得的基因表達(dá)變化量的log2值進(jìn)行篩選，最后用DAVID網(wǎng)站進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路分析。

1.6 染色質(zhì)開放性檢測(cè)

制備細(xì)胞核懸液，然后依次進(jìn)行轉(zhuǎn)座、純化和DNA文庫(kù)擴(kuò)增，最后送華大基因應(yīng)用ATAC-seq檢測(cè)染色質(zhì)開放性。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)

采用qPCR檢測(cè)基因的表達(dá)量，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自Takara公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后應(yīng)用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qPCR，并用 2-△△Ct評(píng)估基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以x2±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組超聲心動(dòng)圖比較

與對(duì)照組比較，心肌肥大組小鼠的LVIDd、EF和FS均顯著下降，LVPWd和LVPWs均顯著升高，差異有顯著性（t=-5.616～8.750，Plt;0.05）;兩組IVSd、IVSs、LVIDs和HR比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。見(jiàn)表1和圖1。表明心肌肥大模型建立成功。

2.2 兩組HE染色結(jié)果比較

對(duì)照組心肌細(xì)胞為橢圓形，排列整齊，細(xì)胞核大小均一，心肌纖維排列整齊（圖2A）。心肌肥大組心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維出現(xiàn)不同程度增生，排列紊亂（圖2B）。

2.3 兩組Masson染色結(jié)果比較

Masson染色心肌細(xì)胞為紅色，膠原為藍(lán)色。對(duì)照組心肌細(xì)胞間隙沒(méi)有膠原增生（圖2C）。心肌肥大組心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化并有膠原堆積（圖2D）。進(jìn)一步證明心肌肥大模型建立成功。

2.4 基因差異表達(dá)情況

應(yīng)用生物信息學(xué)工具對(duì)基因進(jìn)行GO 生物學(xué)進(jìn)程分析和 KEGG通路分析（圖3A、B、C）。結(jié)果表明，GO生物學(xué)進(jìn)程分析主要富集到炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血管生成、心肌收縮和鈣穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)功能;KEGG通路分析主要富集到PI3K-Akt 通路、心肌肥大、鈣離子信號(hào)通路、Rap1通路、cAMP通路、Ras通路、Foxo通路、AMPK通路、cGMP-PKG通路和MAPK通路等。篩選出27個(gè)與心肌肥大相關(guān)的基因（圖3D），其中8個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，分別為α肌球蛋白重鏈（myh6）、Foxp1、Sirt3、Sirt2、Ppargc1a、Ppargc1b、心肌肌漿網(wǎng) Ca2+-ATP 酶 2a（Atp2a2）、Trim63;19個(gè)表達(dá)上調(diào)，分別為心房鈉尿肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、α骨骼肌肌動(dòng)蛋白（Acta1）、β-肌球蛋白重鏈（myh7）、Col3a1、Col1a1、CYP1B1、Fn1、Il18、CD36、Timp1、Tgfbr1、PDE1C、PDE1A、Sirt1、Sirt4、Pfkp、CDK1和Fbln2。 篩選出23個(gè)與心肌疾病相關(guān)的基因（圖3E），其中13個(gè)表達(dá)下調(diào)，分別為DSP、Timp3、Sgcb、Hfe、Ldb3、Fktn、Apln、Fkrp、Prkce、Sgca、Pdgfa、Prkaa2、Gja1;10個(gè)表達(dá)上調(diào)，分別為Mapk8、Rtn4、Dcn、Myot、Ptk2b、Ppbp、Xdh、Tnfrsf1b、Ctnnb1、Cxadr。

2.5 染色質(zhì)開放性情況

開放結(jié)構(gòu)主要位于基因間區(qū)域，其次是內(nèi)含子區(qū)域;基因的外顯子、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域的peak占比相同（圖3F）。心肌肥大后，基因間區(qū)域的peak在總體中占比有所下降，而內(nèi)含子、外顯子、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域的peak占比有所增加。通過(guò)IGV軟件可視化分析部分肥大基因相應(yīng)區(qū)域，結(jié)果表明心肌肥大后，ATAC-seq信號(hào)在NPPA、NPPB和Acta1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近區(qū)域有所增強(qiáng);此外，在肥大發(fā)生之前這些基因就存在一定的開放性（圖3G）。

2.6 兩組marker基因比較

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，心肌肥大組marker基因ANP、BNP、β-MHC和Acta1表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，差異有顯著性（t=4.685～7.124，Plt;0.05）。見(jiàn)圖4。說(shuō)明心肌發(fā)生了明顯肥大。

3 討 論

心肌肥大是心臟為了應(yīng)對(duì)內(nèi)、外部生物學(xué)應(yīng)力刺激而做出的應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重危害人類健康[1]。心肌肥大主要特點(diǎn)是心室壁變厚，心肌細(xì)胞體積變大，并伴有心肌功能障礙和纖維化。本研究超聲檢測(cè)和免疫組化結(jié)果均說(shuō)明本研究制備的心肌肥大模型特征與其一致。

本研究差異表達(dá)基因的GO功能和 KEGG通路分析得到的心肌肥大相關(guān)通路與NAKAMURA等[12]研究結(jié)果相同。心肌肥大發(fā)生后，與心肌肥大相關(guān)的基因隨之發(fā)生差異表達(dá)，其中，marker基因ANP、BNP、Acta1、myh7等的表達(dá)升高，而myh6的表達(dá)下降，進(jìn)一步證明心肌肥大模型構(gòu)建成功。在心肌肥大相關(guān)的基因中，Col3a1、Col1a1、Fn1、Il18、Timp1和Tgfbr1與心肌纖維化和膠原生成相關(guān)，其表達(dá)升高說(shuō)明心肌發(fā)生纖維化，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[3-6，13-16]。另有研究表明，PDE1既參與心臟病理性重塑和纖維化，又與鈣調(diào)蛋白相互作用，通過(guò)PKG通路調(diào)控心肌肥大[3]。Fbln2與TGFβ共同調(diào)控TAK1發(fā)生磷酸化，繼而激活P38/JNK、CaN-NFAT和NF-kB信號(hào)通路，促進(jìn)心肌肥大[17]。Foxp1參與心臟重塑、心肌纖維化、成肌纖維細(xì)胞形成、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白生成和心肌肥大[18]，這些研究所涉及的心肌肥大相關(guān)基因在本研究中也呈現(xiàn)出相同的表達(dá)結(jié)果。此外，在心肌肥大相關(guān)基因中，一些基因涉及心肌功能、代謝功能和心律失常，如Sirt1、Sirt2、Sirt3和Sirt4等與線粒體能量代謝密切相關(guān)。有研究表明，心肌肥大后去乙酰化酶的持久性失活會(huì)導(dǎo)致線粒體蛋白高度乙酰化和能量代謝紊亂，Sirt3引發(fā)線粒體相關(guān)蛋白高度乙酰化，導(dǎo)致心肌肥大和纖維化[12]。而CYP1B1、 Ppargc1a和Ppargc1與心肌肥大的代謝重編程相關(guān)，CD36和Atp2a2能導(dǎo)致心律失常和心功能障礙，Trim63、Pfkp和CDK1參與調(diào)控心肌肥大[19-23]。

另外，本文研究在差異表達(dá)的基因中還獲得一些與心肌疾病相關(guān)的基因，其中Tnfrsf1b和Prkce與代謝疾病相關(guān)[21]，Myot 和Ldb3與肌原纖維性心肌病相關(guān)[24]，F(xiàn)ktn和Fkrp與肌營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的心肌病相關(guān) [25]，Ppbp是潛在的冠心病標(biāo)志物[26]，Hfe參與血色素沉著癥誘發(fā)的心肌病[27]，Prkaa2在進(jìn)展性心肌病中發(fā)揮作用[21]，Timp3參與鐵超負(fù)荷介導(dǎo)的心肌病[28]。除此以外，本研究在差異表達(dá)的基因中，還獲得一些涉及心臟功能的基因，其中Ptk2b、Pdgfa、Dcn和Apln調(diào)控心臟纖維化[29-32]，CXADR和DSP介導(dǎo)心律失常 [33-34]，而Mapk8 和

Ct-nnb1分別是腎素-血管緊張素通路和Wnt通路的核心參與者[21，35]，Rtn4調(diào)節(jié)血管生成[36]，Gja1和Xdh與線粒體功能相關(guān)[28，37]，Sgca和Sgcb是肌糖復(fù)合物形成的必要成分[21]。基因差異表達(dá)分析表明，AngⅡ在誘導(dǎo)心肌肥大的過(guò)程中，除了能導(dǎo)致心肌肥大以外，還可能導(dǎo)致與心肌疾病和心肌功能相關(guān)基因發(fā)生差異表達(dá)。

本文研究分析ATAC-seq信號(hào)在不同順式調(diào)控元件區(qū)域上的分布，結(jié)果顯示，心肌肥大組中啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域的peak所占比例較對(duì)照組有所增加，這與其參與調(diào)控基因表達(dá)的功能密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)心肌肥大marker基因相應(yīng)區(qū)域分析顯示，心肌肥大后，在NPPA、NPPB和Acta1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近區(qū)域的染色質(zhì)開放性有所增強(qiáng)，這可能為它們表達(dá)升高的原因。

綜上所述，本文應(yīng)用RNA-seq和ATAC-seq兩種高通量測(cè)序技術(shù)，研究心肌肥大后基因表達(dá)以及特征基因的染色質(zhì)開放性。結(jié)果顯示，心肌肥大后，與心肌肥大和心肌疾病相關(guān)的基因表達(dá)具有明顯的差異，心肌肥大特征基因（如ANP、BNP、Acta1）在染色質(zhì)開放水平上明顯提高，揭示了導(dǎo)致心肌肥大特征基因表達(dá)升高的潛在因素。本文在兩個(gè)不同層次水平上檢測(cè)了心肌肥大發(fā)生后的數(shù)據(jù)，為后期更深層次地研究心肌肥大相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以及更詳細(xì)地了解驅(qū)動(dòng)心肌細(xì)胞肥大的分子變化提供了數(shù)據(jù)支持，更為開發(fā)逆轉(zhuǎn)心肌肥大病理性重塑的治療方法提供了參考。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）