石漠化生境對三葉木通生長及生理特性的影響

于曉松,王曉紅,李 林,劉 智,楊寧線,張明生

貴州大學生命科學學院/山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室,貴陽 550025

喀斯特石漠化是一種人為造成的土地退化過程,廣泛分布于中國西南地區,尤以貴州最為嚴重,已成為我國三大生態災害之一[1—2]。對此國內外學者在治理石漠化方面開展了大量的研究,宏觀尺度上利用層次分析法、壓力響應模型等方法對石漠化區域植被恢復情況和影響因子進行定量研究[3—4]；微觀尺度上通過引入外來植被對石漠化生境進行修復,減緩其退化[5—6]。但受地質因素制約,石漠化生境成土速率慢且土被不連續,土壤富鈣而偏堿性且土層淺薄,保水能力差,極大的限制了植被的生產力[7]。因此以上方法雖然對石漠化治理得到了一定的改善,但由于植被選擇不當,治理后的植被生態穩定性差、抵抗力弱,導致石漠化治理成效并不明顯,治理成果難以維系[8]。

三葉木通(Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.)作為一種多年生藤本植物,是貴州本土重要的藥食兩用植物,被《中華人民共和國藥典》(2020版)收錄[9],其果實可食用,不同器官也可制作成茶、酒和食用油等[10—11]。同時三葉木通作為石漠化生境適生物種,用其治理石漠化生境,不僅能夠改善喀斯特石漠化生境,還能夠為當地帶來較大的經濟效益。而植被在面對逆境時會改變外部形態和內部生理生化形成特定的生存策略,從而抵御和適應逆境[12],如植物生長受到抑制[13]、光合作用的改變[14]、各種氧化酶的協調作用[15]以及自身有機滲透物質的調節等[16]。不同植物面對逆境時會有不同的生長及生理適應策略,且目前僅局限于對根、莖和葉等單一器官進行研究,鮮有學者從植物各器官進行系統的研究。而三葉木通作為治理石漠化生境的經濟物種之一,其各器官如何通過形態及生理生化的改變來適應石漠化生境還未見報道,機理也并不清楚。因此開展石漠化生境下三葉木通生長生理響應機制顯得尤為重要。

本研究以三葉木通為材料,通過對石漠化生境和普通生境下植株的生長和生理生化指標動態變化的對比分析,了解三葉木通響應石漠化生境的生理調節機制,為指導三葉木通綜合治理石漠化生態環境提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗地點

以貴州省的貴陽市花溪區石板鎮蘆荻村(以下簡稱“花溪基地”)和安順市關嶺縣花江鎮中寨村(以下簡稱“關嶺基地”) 2個典型喀斯特地貌區域作為實驗地(其中一地作為實驗重復),分別在兩地各選取一處石漠化生境(>1000 m2),同時從其附近各選取一處普通生境(非石漠化區域)作為對照(>1000 m2),各基地地理及氣象數據(表1)來源于貴州省氣象局檔案館。

表1 不同基地地理及氣象數據

1.2 實驗材料與實驗設計

三葉木通(Akebiatrifoliata(Thunb.) Koidz.)種苗由貴州大學農學院中藥材研究所提供,選擇生長健壯、無病蟲害、長勢基本一致的一年生苗為種植材料,在4月初進行統一種植并取土壤進行理化性質檢測(表2),對相同基地不同生境進行顯著性分析。結合表1和表2,可知“花溪基地”和“關嶺基地”具有相似的環境要素,作為實驗的兩個重復處理。本文重點檢測石漠化對植物生理生態和生長表現的影響,而植物不同表現來源于石漠化的影響而非不同基地的生長條件差異。普通生境按株行距為2 m×3 m栽種并搭架,石漠化生境則根據實際情況進行栽種,并分成10個小區,自然降雨,不添加任何肥料,使其自然生長。在各小區隨機抽取6株長勢基本一致的植株,其中3株用于生長指數測定(每隔30 d左右進行一次),另外3株用于生理生化指標測定。取樣時,選取植株上部1 m處莖段和葉片以及土層20 cm內的根為材料,裝入自封袋后冰盒保存迅速帶回實驗室,液氮速凍,-80 ℃保存。

表2 不同生境下土壤理化性質(平均值±標準差)

1.3 指標測定方法

1.3.1生長指標

株高用皮尺測量；莖粗用游標卡尺測量；葉片數用計數法。

1.3.2生理指標

選取各基地不同生境下三葉木通中部枝條的成熟功能葉,在急速生長期7月份于10點整使用YZQ- 100C熒光-光合儀(翼鬃麒科技, 北京),選用封閉控光葉室,設置有效光強為1500 μmol m-2s-1,測定凈光合速率(Pn)及影響因子,包括氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)并計算水分利用率(WUE=Pn/Tr),每個栽培地重復3株。

相對含水量(RWC)采用烘干稱重法,葉片葉綠素含量采用乙醇-丙酮法,丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸(TAB)法,相對電導率(RC)用電導儀(雷磁DDS307, 上海)測量,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法,過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法,過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法,脯氨酸(Pro)含量采用磺基水楊酸法,可溶性糖(SS)含量采用硫酸蒽酮比色法；可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍法[17]。以上指標均以鮮重測量,3次重復。

1.3.3數據分析

所有數據處理用Excel 2010和SPSS 19.0進行統計,用Origin 2019 b作圖,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比較檢驗處理間差異性。

為了更加全面、系統地評價三葉木通在石漠化生境下的生長生理響應,對實驗中各時期、各器官部位的相關生長和生理生化指標的平均值進行主成分分析。為消除材料間的差異,采用抗逆系數方法進行主要響應指標評價(抗逆系數=逆境脅迫下的測定值/對照下測定值)[18]。

2 結果與分析

2.1 石漠化生境對三葉木通生長的影響

形態指標是植物生長最直觀的體現。本試驗中,與對照相比石漠化生境下三葉木通的株高降低、莖粗縮小和葉片數減少(圖1),關嶺、花溪兩個基地的石漠化生境下三葉木通株高相差不大,兩個基地普通生境下的株高差異亦不明顯；但石漠化生境下的株高顯著低于對照,關嶺基地平均株高相差0.6 m,花溪基地平均株高相差0.8 m。石漠化生境下的莖粗也明顯小于對照,在8月份最顯著,關嶺基地莖粗在石漠化生境下比對照相差1.34 mm,花溪基地相差0.42 mm。石漠化生境下植株葉片數也少于對照,關嶺基地較為顯著,其相差多達120片。

圖1 不同生境下三葉木通各時期的生長狀況(平均值±標準誤)

2.2 石漠化生境對三葉木通光合相關指標的影響

光合作用是植物最重要的基礎生理活動,為植物生長發育提供所需的物質和能量[19]。由表3可知,在兩個基地,不同生境條件下植株凈光合速率差異顯著,石漠化生境下的Pn顯著低于普通生境,其影響因子Gs和Tr顯著下降,Ci上升,WUE下降。

表3 不同生境下三葉木通的光合特性及水分利用率(平均值±標準差)

水分是植物的重要組成成分,是控制植物光合作用和生物量的主要因素之一[20]。隨著時間的推移,普通生境下植株各器官的RWC變化不大,而石漠化生境植株的RWC減少,并逐漸低于對照,達到了極顯著水平(圖2)?？梢?石漠化生境會使三葉木通的RWC降低。

圖2 不同生境下三葉木通的相對含水量(平均值±標準誤)

葉片是光合作用的主要場所,葉片葉綠素含量是影響植株光合作用的重要指標之一[21]。由圖3可見,葉綠素a和葉綠素b含量隨著時間進程總體呈現升高,且石漠化生境下顯著低于對照。

圖3 不同生境下三葉木通的葉綠素含量(平均值±標準誤)

2.3 石漠化生境對三葉木通細胞膜保護系統的影響

細胞膜的選擇透過性能夠維持細胞微環境和正常代謝,在遭遇損傷時會產生膜脂過氧化物(MDA),其含量可反應植物的逆境傷害程度[22]。三葉木通在石漠化生境下的MDA顯著高于對照,隨著時間的延長,MDA呈先急速增長,后減緩趨于平穩(圖4)。

圖4 不同生境下三葉木通的丙二醛含量(平均值±標準誤)

相對電導率通過反映膜透性的大小而驗證逆境對生物膜的傷害程度[23]。石漠化生境可造成三葉木通葉片細胞膜系統的嚴重損傷。圖5顯示,石漠化生境下三葉木通的相對電導率均顯著高于普通生境,尤以8月份相差最為顯著,隨后電導率開始下降。

圖5 不同生境下三葉木通葉片的相對電導率(平均值±標準誤)

植物SOD、POD和CAT是植物體內清除活性氧和自由基的3種關鍵酶,而活性氧的清除能力是衡量植物抗逆性的關鍵指標[24]。由圖6可見,POD活性隨時間延長呈先上升后減緩,其中石漠化生境對三葉木通根和葉的POD活性影響不顯著,但莖段的POD活性顯著高于對照；SOD活性隨時間延長變化較為平緩,石漠化生境下三葉木通葉片SOD活性顯著高于對照,而在根、莖中的變化無規律；CAT活性隨時間延長呈先上升后平緩,根中CAT活性在石漠化生境下顯著高于對照,莖中CAT活性差異不大,關嶺基地石漠化生境下葉片中的CAT活性要顯著高于普通生境,而花溪基地并未出現此現象。

2.4 石漠化生境對三葉木通滲透調節物質的影響

植物可通過滲透調節物質來維持體內水分平衡和細胞間膨壓以抵抗逆境[25]。SS、SP和Pro是植物體內重要的滲透調節物質,對保持原生質與環境的滲透平衡起重要作用[26]。本研究發現,隨著時間進程,石漠化生境和對照下的三葉木通各器官中SS含量幾乎均呈上升趨勢,且石漠化生境下多高于對照,其最大值出現在根中(圖7)；SP整體呈現升高趨勢,根、莖、葉中的含量均高于對照,其最大值在葉片中(圖8)；Pro整體呈現升高趨勢,根、莖、葉中的含量的均高于對照(圖9)。

圖8 不同生境下三葉木通的可溶性蛋白含量(平均值±標準誤)

圖9 不同生境下三葉木通的脯氨酸含量

2.5 三葉木通對石漠化生境的適應性綜合評價

主成分分析法可將多個原始指標轉換為綜合指標進行分析,這樣能綜合反映植物的抗逆性[27]。根據特征值大于1的原則,對兩個基地的三葉木通生長和生理生化共14個指標進行主成分分析(圖10),關嶺基地的第一個主成分是MDA>POD>Chla>SP,第二個主成分是CAT>SS>RWC；花溪基地的第一個主成分是MDA>POD>SP,第二個主成分是CAT>SS>Chlb。綜合分析,MDA、POD和SP在三葉木通適應石漠化逆境中占重要地位,且兩個基地呈現出最主要的成分皆為MDA。

圖10 不同生境下三葉木通各指標的主成分分析

3 討論

石漠化生境作為一種典型的逆境脅迫,在眾多逆境因素協同作用下,不僅改變植物的形態,對植物的生理生化特性改變也十分顯著,因此植物對待逆境脅迫的表現則是一個復雜的綜合性狀[28]。而喀斯特石漠化生境最典型的特征便是缺水干旱。本研究發現,石漠化生境下三葉木通的株高、莖粗以及葉片數等生長形態會發生降低現象,由此可知三葉木通面對石漠化生境是一種被動性適應。此變化不僅能夠避免植物因蒸騰作用造成的水分大量散失,維持植物整體的水分平衡[29],同時也減少了植物地上部的生物量,提高資源利用率,從而適應環境的改變[30]。

光合作用是植物最重要的合成代謝過程之一,其受植物器官的RWC和葉綠素等眾多指標影響[31]。本研究發現,石漠化生境下三葉木通的各器官RWC均隨脅迫時間的延長而逐漸降低,葉綠素a與葉綠素b也呈現下降趨勢,這與俞樂等[32]研究相符合。其原因可能是石漠化生境使三葉木通水分缺失,從而抑制葉綠素的合成,進而會造成植物光合速率降低[33],這與本研究Pn下降相符合。而Pn受氣孔因素和非氣孔因素影響,本研究中發現石漠化生境下三葉木通的Pn下降,伴隨著Ci呈現上升趨勢,Gs呈現下降趨勢,由此可以判斷石漠化生境下三葉木通的Pn下降是由于非氣孔因素導致[34]。據鄭俊明研究表明[35],非氣孔因素導致Pn下降說明三葉木通的光系統和酶系統被石漠化生境所破壞。

逆境會對植物的細胞膜結構和功能造成傷害,導致質膜透性增加,使膜穩定性降低,進而導致細胞內流出大量的離子和大分子物質,對植物造成氧化傷害和滲透性傷害[36]。MDA和RC則是衡量植物細胞膜受損情況的重要指標[37]。本研究發現,石漠化生境下三葉木通各器官部位的MDA含量和葉片的RC呈現上升趨勢,由此說明石漠化生境會對三葉木通的細胞膜造成損傷,這與劉錦春等[38]研究相符合。而植物自身會提高一些抗氧化酶活性抵御細胞膜的氧化傷害,但酶活性的提高在各器官中存在一定的差異。SOD是以氧自由基為底物的酶,可猝滅超氧負離子的毒性,終止由超氧負離子啟動的一系列自由基連鎖反應所造成生物毒損傷,本研究發現其活性在三葉木通葉片中提高最為顯著。POD是一種以鐵卟啉為輔基的氧化酶,能夠催化H2O2氧化某些酚類、芳香胺和抗壞血酸等還原性物質,本研究發現其活性在三葉木通莖中提高最為顯著。CAT是一種酶類清除劑,能夠清除植物體內的H2O2,使細胞免遭毒害,本研究發現其活性在三葉木通根中提高最為顯著。由此可知,石漠化生境會對三葉木通細胞膜系統造成氧化損傷,而三葉木通會通過提高根中的CAT活性、莖中的POD活性和葉中的SOD活性,協同作用共同抵御自由基造成的氧化損傷。

逆境下,植物會通過調節滲透性物質的含量來維持體內水分平衡和細胞間膨壓,以此抵御逆境造成的滲透性傷害[22]。本研究發現,石漠化生境下三葉木通的各器官中Pro和SP會明顯增加,這與歐芷陽等[16]研究相符合。其中Pro是一種防脫水劑,其含量的增加能夠幫助三葉木通在石漠化生境下束縛更多的水,從而阻止細胞膜脫離,增強細胞保水能力,穩定細胞結構等功效[39]。SP含量的增加可能原因是石漠化生境加快了三葉木通有機物質的形成、轉化和運輸,使得SP在營養器官中產生大量的積累,從而維持生命過程[40]。同時Chaves等[41]研究發現脯氨酸的積累可以防止蛋白質結構受到破壞,以穩定抗氧化酶的活性和功能,因此伴隨著Pro含量的增加,SP含量也隨之上升。但石漠化生境下,三葉木通的SS含量僅在根中會有所提高,相比于其他滲透性調節物質(Pro、SP)表現出一定的滯后性,表明三葉木通中SS對石漠化生境的響應強度要顯著低于其他滲透調節物質,可能原因是因為植物為了適應逆境,消耗可溶性糖進行植物體內的代謝調節或者可溶性糖的合成受到了抑制,故植物體內可溶性糖含量變化不大[42]。

植物對石漠化生境的抗逆性是一個復雜的綜合性狀,由眾多指標協同抵御傷害,各指標之間存在著一定的關聯,其重要性也不盡相同。利用普通的方法很難從眾多因素中綜合評價植物對石漠化生境的主要響應指標。因此本研究結合前人相關研究,通過主成分分析對三葉木通在石漠化生境的抗逆性進行綜合評價。本研究發現,在三葉木通抵抗石漠化生境中起主要作用的第一主成分是MDA和Chla,其含量變化能夠反映出三葉木通的損傷程度和光合速率,可見石漠化生境對三葉木通造成最主要影響為氧化傷害和光合速率；第二主成分主要包括POD、Chlb等,第三主成分則為RWC和株高,可見這些指標協同作用使三葉木通可通過減少活性氧的傷害,提高自身的滲透調節能力,減輕細胞遭受的損傷以及改變自身生長形態,從而適應喀斯特石漠化生境。本研究僅局限于三葉木通的生長及生理生化指標的測定,對其分子響應機理及其相關控制基因還有待進一步探究。

4 結論

通過對比分析,本研究發現三葉木通在石漠化生境下形態、生理生化方面等都會發生顯著的改變。其中表現為降低株高、縮小莖粗和減少葉片數等形態方面,降低凈光合速率、提高POD、SOD和CAT等抗氧化酶活性、增加SP、Pro和SS等滲透性調節物質含量等生理生化措施,進而適應石漠化生態環境。通過主成分分析,發現MDA、POD和SP等指標在三葉木通對石漠化逆境應答機制中起主要作用。本研究初步揭示了三葉木通對石漠化生境的應答機制,同時也為通過三葉木通綜合治理喀斯特石漠化生態環境提供了一定的理論依據。