褪黑素對高溫脅迫下生菜抗氧化酶系統的影響

王 譯，韓瑩琰，郝敬虹，劉超杰，范雙喜

(北京農學院 植物科學技術學院，北京102206)

生菜，又名葉用萵苣(LactucasativaL.)，喜冷涼環境，生長最適溫度為15～20 ℃，超過30 ℃則會出現生長不良，且極易抽薹[1]。高溫脅迫會使生菜產量下降、商品性降低，不耐熱品種反應更加明顯[2]。

近年來，全球氣候變暖對農業生產的影響也越來越大[3]。高溫會引起植物體內活性氧的產生，從而造成氧化損傷[4]，當植物體內活性氧活性氧的清除不能與產生的速率達到統一，會導致細胞受到傷害。在高溫環境下，過量的活性氧使膜脂過氧化，在膜脂氧化時會產生丙二醛(MDA)，表現出明顯的細胞毒性。逆境下植物細胞質膜透性以及其過氧化產物含量是評價植物抗逆性的重要指標。在受到高溫脅迫時，植物會產生一系列的熱激反應，激活抗氧化酶防御系統進行自我保護[5]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是組成該系統的重要酶。這些酶可以清除細胞產生的自由基，將活性氧控制在穩定的范圍內，維持植物的正常生理活動。

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺，Melatonin，MT)廣泛存在于植物體內，對植物生長和發育方面有重要的作用。褪黑素在植物抵御干旱脅迫、鹽脅迫、溫度和氧化脅迫等不良影響中體現出重要作用[6]。在植物對抗氧化脅迫時尤為突出[7]。前人的研究表明，在高溫脅迫條件下，外源褪黑素能夠提高抗氧化酶系統中部分酶的活性，降低植物體內由于環境脅迫產生的活性氧含量，減輕細胞膜的損傷，緩解高溫對植物的不利影響[8,9]。目前，褪黑素調節玉米、大豆代謝方面的研究相對深入，但高溫脅迫下外源褪黑素對生菜幼苗的作用效果尚不明確。

本試驗以熱敏感生菜品種‘北散生3號’為材料，采用水培方式，通過葉面噴施50 μmol/L褪黑素，探明高溫環境下外源褪黑素調節生菜抗氧化酶系統的生理機制，為進一步研究外源褪黑素緩解高溫脅迫對生菜造成的不利影響提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗生菜為北京農學院課題組提供的熱敏感品種‘北散生3號’。

1.1 基礎試驗

選取顆粒大小一致、無病害的生菜種子。蒸餾水浸種4 h，在培養皿中平鋪用蒸餾水浸潤的濾紙，把生菜種子均勻分布在濾紙上。放置于光照培養箱中進行催芽，設置晝夜溫度為20 ℃/15 ℃，光照強度為200 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h/12 h，相對濕度為70%～75%。每2 d補充去離子水，觀察種子發芽情況。將發芽后的生菜種子移植到水培育苗盤中，繼續在上述光培養箱中培育。生菜幼苗培育至3葉1心時，挑選長勢良好、生長狀況一致的植株，移栽到11孔水培箱中，置于計算機智能溫室中繼續培育，設置光周期為12 h/12 h，晝夜溫度為20 ℃/15 ℃，光照強度控制為200 μmol·m-2·s-1，相對濕度為70%～75%。待幼苗長至5葉1心時開始處理。將其轉移至晝夜溫度設置為30 ℃/25 ℃的溫室進行處理。

實驗室前期相關試驗得出高溫脅迫下生菜幼苗生長最適褪黑素質量濃度為50 μmol/L 。

1.2 試驗設計

設置3個處理：(1)CK，正常溫度，噴施去離子水；(2)H，高溫環境，噴施去離子水；(3)H+MT，高溫環境，噴施50 μmol/L褪黑素。

每天8:30使用小型噴霧器噴施去離子水和50 μmol/L褪黑素溶液，在葉面和葉背均勻噴施，以噴施液體全部潤濕葉面，但不下滴為基準。試驗共進行8 d，第8天收獲生菜并測量其形態指標和水分生理指標，并在處理的0、2、4、6和8 d傍晚18:00采集主要功能葉測定其他指標。

1.3 測定方法

選取生長一致的植株測量株高，地上部分和地下部分的鮮質量和干質量，并計算相對含水量。

葉綠素含量測定采用95%乙醇浸提法[10]，測定丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸法[11]，測定過氧化氫酶(CAT)的活性采用過氧化氫紫外分光光度法[12]；測定過氧化物酶(POD)活性用愈創木酚法[12]；測定超氧化物歧化酶(SOD)活性用 NBT(氮藍四唑)光化學還原法[12]。

試驗數據使用SPSS 24(IBM，美國)進行差異顯著性分析(LSD，P<0.05)。圖表均使用Excel 2019(Microsoft，美國)制作完成。

2 結果與分析

2.1 外源褪黑素對高溫下生菜幼苗生長的影響

如表1所示，高溫脅迫下生菜幼苗株高明顯高于對照，噴施MT株高有所降低但效果不顯著。高溫脅迫使生菜幼苗的植株含水量顯著降低， MT處理后生菜幼苗含水量均顯著高于高溫處理。高溫脅迫下噴施褪黑素對生菜幼苗鮮質量和干質量沒有顯著影響。以上數據表明，噴施外源MT可以緩解高溫脅迫造成的植株相對含水量降低，但對株高增長沒有顯著影響。

表1 外源褪黑素對高溫脅迫下生菜生長的影響Tab.1 Effects of exogenous MT on growth of lettuce under high temperature stress

2.2 外源MT對高溫脅迫下生菜葉綠素含量的影響

如圖1所示，高溫環境下生菜葉片中葉綠素含量與對照相比出現明顯變化，且葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量變化趨勢一致。脅迫至4 d，葉片中的葉綠素含量開始出現變化，表現為含量上升。并隨著脅迫時間的延長，生菜植株葉片中的葉綠素含量逐漸積累。脅迫至8d生菜葉片中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量分別是對照的1.53倍、1.81倍、1.60倍。高溫噴施褪黑素后葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量有所降低，但是沒有改變葉綠素含量的積累趨勢。結果說明，外源褪黑素對高溫環境下生菜葉片中的葉綠素含量無顯著影響。

圖1 外源MT對高溫脅迫下生菜葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of exogenous MT in chlorophyll content of lettuce under high temperature stress

2.3 外源褪黑素對高溫脅迫下生菜丙二醛含量的影響

如圖2所示，高溫脅迫下生菜幼苗葉片中丙二醛含量顯著高于對照，并隨著脅迫天數的增加逐漸積累，6 d時與對照相比最為明顯，是對照的1.48倍。高溫脅迫下噴施褪黑素，丙二醛含量從4 d開始與高溫出現差異，4 d、6 d、8 d的丙二醛含量較高溫脅迫分別下降了11.28%、6.66%、8.44%。以上結果表明，高溫脅迫下噴施褪黑素能夠減少生菜幼苗中丙二醛的積累。

圖2 外源褪黑素對高溫脅迫下生菜丙二醛含量的影響Fig.2 Effect of exogenous MT on the MDA content in lettuce under high temperature stress

2.4 外源褪黑素對高溫脅迫下生菜葉片抗氧化酶活性的影響

如圖3所示，在持續8 d的高溫脅迫中，CAT、SOD活性呈現先升高后降低的趨勢，POD活性逐漸升高。高溫脅迫至8 d，CAT、POD、SOD活性都顯著低于對照，且降低程度由高到低依次為CAT、SOD、POD。高溫脅迫下噴施褪黑素顯著提高CAT、SOD活性，6 d、8 d活性升高最為顯著。8 d時噴施褪黑素的CAT、SOD活性分別是高溫的2.41倍、3.60倍。外源褪黑素對POD活性的影響8 d出現變化，與高溫相比POD提高了17.0%。以上結果表明，外源噴施褪黑素能夠顯著緩解高溫脅迫對CAT、SOD活性的影響，在8 d的處理時間內對POD活性有所提升但效果不明顯。

圖3 外源褪黑素對高溫脅迫下生菜幼苗的抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of exogenous MT on antioxidant enzyme system of lettuce under high temperature stress

3 討 論

高溫脅迫嚴重影響著植物的正常生長和發育[13]。本試驗中，高溫環境對生菜幼苗的生長有顯著的影響，表現為葉片皺縮、徒長抽薹，相對含水量顯著降低。高溫噴施褪黑素減輕了抽薹現象，其鮮質量、干質量、相對含水量也有所恢復，外源噴施褪黑素能夠緩解生菜幼苗不良的生長狀況。

植物的光合作用對溫度較為敏感，葉綠素作為光合作用中的重要色素，其含量變化能夠反映出植物的抗逆能力。有研究表明高溫脅迫會使葉綠素的含量顯著減少，一般認為其原因是葉綠體結構被破壞，導致光合色素合成受到影響[14]。而本試驗則不同，高溫脅迫下生菜幼苗葉片中的葉綠素含量顯著升高。有前人的研究表明，干旱脅迫使梔子花葉片的相對含水量降低，葉片生長受阻，葉面積減小，從而造成單位面積葉片的葉綠素含量升高[15]。本試驗中，高溫脅迫對植株的影響出現與干旱脅迫類似的狀況，葉片相對含水量減少，葉片皺縮，最終表現為葉綠素含量升高。

植物細胞膜是抵抗高溫脅迫的重要結構，其熱穩定性與植物體的耐熱性有直接聯系。高溫脅迫對植物細胞的影響反映在很多方面，其中細胞膜受損是主要現象之一[16]。在本試驗中，高溫脅迫使生菜幼苗體內丙二醛含量增加并逐漸積累。外源噴施褪黑素4 d后，丙二醛含量開始降低，說明外源褪黑素所具有的抗氧化能力，能夠幫助生菜幼苗清除活性氧，保護膜脂不被氧化，從而降低丙二醛的含量，減輕對植物的毒害。

綜上所述，高溫環境下外源噴施褪黑素通過參與調控抗氧化系統，提高CAT、SOD、POD的活性，從而減少MDA積累，保護細胞膜的完整性，并減輕高溫脅迫對生菜幼苗的損害，提高生菜耐熱性。