觀賞海棠‘王族’miR156a的克隆及功能驗證

劉嘉偉，王杏隨，潘云雪，侯穎慧，張 杰

(農業應用新技術北京市重點實驗室/植物生產國家級實驗教學示范中心/北京農學院 植物科學技術學院，北京102206)

觀賞海棠(Ornamental Crabapple)是蘋果屬著名的花果共賞材料[1]。包括新葉有色品種和常色紫紅色葉品種，其中紅色葉片‘王族’(Malus‘Royalty’)是常色有色類品種的典型代表[2]。其花色鮮艷、果實胎紅、冬果宿存，兼具抗病、耐旱、生長快等優點[3]。

花色苷作為花青素和各種糖形成的一種糖苷物質，在細胞質內合成后轉運到液泡中積累[4]，然后穩定存在于植物器官中，由此產生由紅到紫的顏色。眾多研究表明，顏色差異與花色苷的含量密切相關[5]花色苷的合成不僅增加了植物的觀賞價值，還提高植物抗氧化、消炎抑菌的生物活性，其合成代謝一直以來都是研究熱點。

MicroRNAs (miRNAs) 是小的非編碼內源性RNA ( 18～24個核苷酸)，參與多種生理代謝過程，如：激素信號轉導與代謝產物的生物合成，以及植物的生長發育和一些脅迫應答等[6]。已有研究表明miRNA是介導植物花青素生物合成的重要調節因子[7]。miR858可以靶向擬南芥花青素合成負調節基因MYBL2參與擬南芥花青素的合成積累[8]。在低磷條件下，miR399參與miR156調控的花青素積累和根際酸化過程，miR156 和miR399 協同參與磷平衡過程[9]。對于高度保守miR156正確的時空積累維持了植物的正常發育。研究表明，miR156及其靶基因SPL家族在植物的發育過程、合成代謝及非生物脅迫中起到重要作用，是植物生長發育的調節樞紐[10]。在楊樹中，miR156過表達導致花青素在莖、葉緣及葉柄表皮中大量積累?；ㄉ障嚓P基因(LDOX，UFGT，GST)的轉錄本豐富度明顯增加，有助于調控楊樹中花色苷的生物合成[11]。在桃和梨中，miR156/SPL介導的兩種機制可調控花色苷生物合成：血肉桃中的PpSPL1通過抑制反式啟動活性PpMYB10.1(花色苷積聚的正調節劑)的表達[12]。 文中所采用的試驗材料是觀賞海棠 ‘王族’，首先進行克隆miR156a的前體基因，接下來把表達載體轉進‘王族’ 植株中。然后進行檢測花色苷含量并分析花色苷代謝途徑上的相關基因的表達量，以此揭示miR156a在花色苷代謝途徑中的作用。

1 植物材料及方法

1.1 植物材料

植物材料觀賞海棠‘王族’在2021年3月中旬取自北京農學院海棠資源圃和組培中心培育的‘王族’植株。進行分裝標記所收集的材料，用液氮迅速存樣，并保存于-80 ℃。侵染試驗所需材料選自觀賞海棠‘王族’植株。在MS培養基中進行植株的培養(4.43 g/L MS粉末，30 g/L蔗糖，7.0 g/L瓊脂，1 mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA，pH=5.8)。適宜的培養條件為：相對濕度70%～80%，溫度24 ℃±2 ℃，光照的強度1 700～2 000 lx，光照的時間16 h光/8 h暗。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取植物總RNA 及反轉錄 cDNA 提取‘王族’葉片的總RNA，使用RA53-EASYspin Plus多糖多酚復雜植物RNA快速提取試劑盒(愛博森)，操作參照說明書進行。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否污染，核酸儀檢測RNA的純度及濃度。并采用RT-PCR試劑盒(全式金)進行反轉錄。

1.2.2miR156a基因克隆 首先用GDR查找‘金冠’的pre-miR156a基因的序列，其在15號染色體上。取大約260 bp的基因序列，在其前體序列的上游和下游位置，結合前體序列組成新序列。引物通過Primer5進行設計。以‘王族’植株葉片反轉錄的cDNA作為模板，PCR反應體系cDNA,2xPhanta Max Master Mix (Dye Plus),上游引物F,下游引物R,ddH2O分別為1 μL,25 μL,2 μL,2 μL,20 μL總量共50 μL。

PCR的反應條件為: 95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸5 min，共進行34個循環。

檢測PCR產物，將目的基因片段條帶進行膠回收。然后將膠回收產物與pEASY-Blunt載體進行連接，并轉化 Trans-T1大腸感受態并涂板進行抗性篩選，挑選單菌落生長后，進行菌液PCR鑒定，然后送測序驗證。

1.2.3miR156a前體表達載體的克隆 用限制性內切酶Xba I酶切，將克隆得到的miR156a前體序列分別構建到PDONR221表達和沉默載體上。反應體系如下：目的基因片段、載體片段、T4 DNA連接酶、2×T4DNA ligase Buffer 分別是3 μL,3 μL,1 μL,1 μL,加ddH2O至10 μL。

將以上體系產物，加入干凈離心管中，慢慢混勻后放置于16 ℃的金屬浴中，進行3～4 h連接后，將得到的產物轉化大腸桿菌感受態，并涂板進行卡那霉素抗性篩選，挑取單菌落生長后進行PCR鑒定，然后進行測序驗證。并按1∶1比例將50%甘油與測序正確的菌液進行混勻，保存于-80 ℃備用。

1.2.4miR156a的瞬時轉化 首先吸取2 μL質粒加入50 μL提前融化的農桿菌感受態(GV3101)細胞里。并涂板培養，然后挑選單菌落生長后進行PCR擴增篩選陽性克隆。將鑒定正確的菌液在28 ℃條件下、200 r/min振蕩過夜培養。室溫下，5 000 r/min離心8 min,收集菌體，與侵染液進行重懸( 10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2+200 μmol/L AS)。將菌液再次懸浮至OD600=0.8。將培養30 d左右且生長健壯，長勢相同的‘王族’組培苗，將侵染菌液利用真空泵抽吸的方式轉化整株組培苗，用干凈濾紙吸干植株表面的液體，立刻接種到固體MS培養基(含有Cef 300 mg/L和Kana50 mg/L)中，在組培室進行培養7～10 d，期間注意觀察表型。

1.2.5 實時熒光定量PCR 參照 SYBR ? Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)酶進行，采用qRT-PCR兩步法，體系參照說明書。反應條件為：預變性、變性、退火、延伸的溫度分別是95 ℃，94 ℃，60 ℃，72 ℃，時間分別是3 min，20 s，30 s，30 s，cycles 39。測定關于花色苷途徑相關結構基因表達量。表1為所用的熒光引物序列。待測樣品的數據均進行3次生物學重復。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 花色苷含量的測定 取存樣后的‘王族’葉片，用液氮迅速研磨成粉末，稱量0.11 g樣品，步驟參照植物花色苷含量測定試劑盒(索寶萊)說明書進行操作。后續用分光光度計，通過測定提取液在530 nm和700 nm 處的吸光度值計算樣本中花色苷的含量。

2 結果與分析

2.1 miR156a前體的克隆和表達載體的構建

以‘王族’葉片cDNA為模板，進行PCR擴增得到長度為489 bp的miR156a前體序列。以miR156a前體序列為模板，在上下游引物前端加酶切位點Xba I的序列，利用T4連接酶連接過表達載體和沉默載體上，通過對載體序列的判定，獲得了miR156a過表達載體(OE-miR156a)和miR156a沉默載體(Si-miR156a)。測序結果為圖1所示。

圖1 比對McmiR156a的表達載體序列Fig.1 Alignment of the expression vector sequence of McmiR156a

2.2 miR156a的瞬時遺傳轉化

通過農桿菌轉化法，將miR156a的表達載體轉入‘王族’植株中，放于組培中心進行培養7～10 d，利用體式熒光顯微鏡觀察表型。與對照相比，OE-miR156a‘王族’葉片呈綠色表型，Si-miR156a‘王族’葉片呈紅色表型，如圖2所示。

圖2 瞬時轉基因‘王族’葉片表型Fig.2 Phenotype of transient genetically Malus ‘Royalty’ leaves

2.3 miR156a的相關表達量的分析

通過熒光檢測瞬時轉化葉片，并對轉基因植株中葉片的花色苷含量進行測定，結果發現花色苷含量在過表達植株葉片中明顯低于對照組，并且在沉默植株葉片中花色苷含量明顯高于對照組。并在轉基因植株中分析CHS、UFGT、DFR基因的表達量。由圖3所示，OE-miR156a的花色苷合成相關基因的表達量呈下降趨勢，Si-miR156a的花色苷合成相關基因的表達量呈升高趨勢。結果表明miR156a參與負調控觀賞海棠葉片中花色苷生物合成。

圖3 花色苷的含量及相關基因的表達量Fig.3 Anthocyanin content and relative expression of some related genes

3 討 論

觀賞海棠是具有綜合觀賞價值的品種[13]。受花色苷積累的影響，葉片色澤是觀賞植物的重要特征之一?；ㄉ諒V泛分布于植物各部位，抗氧化活性使其具有抗炎、保護心腦血管和抗代謝性疾病等作用[14]。它還可以吸引傳粉昆蟲、保護植物花粉活性、提高授粉成功率。因此研究花色苷的調控機制以及相關色素的合成代謝有重要意義[15]。

miRNA不僅在轉錄水平上調節基因的表達，而且在調控植物生長、形態發育等各方面均起重要作用。目前對miRNA的功能研究主要通過miRNA過表達、miRNA基因缺失突變體和靶標模擬技術手段[16]。miR156是植物中保守的一類miRNA，其靶基因SPL為編碼含有SBP-BOX結構域的轉錄因子，在植物中的重要調節作用已成為近年來研究的熱點。擬南芥miR156家族有8個成員(miR156a-h)，其中miR156a與miR156c在控制幼年營養生長期向成年營養生長期轉變過程中起主要作用[9]。

本研究主要通過對觀賞海棠‘王族’中的miR156a前體進行克隆，得到489 bp的miR156a前體序列，并構建表達載體侵染‘王族’組培苗。測定了轉基因‘王族’組培苗的花色苷含量及相關結構基因CHS、DFR、UFGT的表達量，發現OE-miR156a其表達量降低，Si-miR156a其表達量升高。植物的花色苷代謝途徑受多種因素影響：外界環境因素如溫度、光照、水等以及環境的pH、糖類、植物激素等；自身遺傳因素如植物本身產生的色素種類以及相關調控基因差異所起的作用。但是在調控花色苷的合成上，miR156a的表達是否起作用，尚未研究。該結果為進一步探究植物中miR156a對花色苷的代謝途徑提供了一定的理論基礎。