OsHDA703互作蛋白的篩選及其抗RSV的機制

方紫薇, 唐 冉，隆林芳，陳 艷*

(1. 北京農學院 生物與資源環境學院/農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京102206；2.中國科學院 微生物研究所，北京 100101)

酵母雙雜交(Yeast two hybrid)是一種高效的互作蛋白篩選方法，該技術已經被廣泛應用于各類生物的蛋白質互作研究[1]。由水稻條紋病毒(Rice strip virus, RSV)引起的水稻條紋葉枯病給水稻生產造成巨大損失[2]。目前RSV的分布、傳播方式、致病性等，在寄主的先天免疫防御、流行病學等方面的研究也得到了進展[3]，但是寄主對病毒的抗性機制還有待研究。因此,研究RSV侵染下，水稻體內的蛋白互作，對闡明抗RSV的機制有重要的作用。

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的功能是去除組蛋白中的乙酰基，使染色質更加緊密，從而轉錄因子與DNA結合的可行性降低，進而抑制轉錄[4]。目前，擬南芥、水稻等多種植物中的組蛋白去乙酰化酶被鑒定出來，將其分為三個亞家族，分別為RPD3/HDA1家族、Sir2家族和HD2家族[5]。目前在水稻中已報道了18個編碼HDAC的基因，其中組蛋白去乙酰化酶703(簡稱OsHDA703)屬于RPD3/HDA1型[6]，也被稱為OsHDAC3。

研究表明OsHDA703調控了組蛋白H4的乙酰化水平，并參與調控種子形態和生殖發育過程[7]，而且Jang等報道OsHDA703主要在根和愈傷組織細胞中表達[8]；2020年研究還發現了OsHDA703與油菜素內酯(Brassinosteroids，BR)信號傳導的下游信號分子OsBZR1互作，調控BR信號通路，影響水稻生長和抽穗期[9]。這些結果說明OsHDA703參與了水稻生長發育的調節過程。2008年，Kim等發現擬南芥中的組蛋白去乙酰化酶19(AtHDA19)分別與轉錄因子WRKY38和WRKY62相互作用，調控了擬南芥抗細菌的相關免疫途徑[10]。作為AtHDA19在水稻中的同源蛋白，本研究期望發現OsHDA703是否也參與調控水稻抗RSV的免疫反應，并篩選其互作蛋白,旨在為OsHDA703在水稻抗病方面的生物學功能及作用機制的研究提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體、試劑和培養基

大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株Y2H Gold和Y187、水稻品種“日本晴”(OryzasativaL.Nippobare)、酵母文庫(感染RSV的日本晴水稻的mRNA) ，均由中國科學院微生物所顏永勝課題組提供。

質粒pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-53、pGADT7-T、pGBKT7-Lam(TaKaRa，中國上海)購自上海歐易生物醫學科技有限公司。酵母四缺陷型氨基酸混合物(Dropout Supplement)、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和組氨酸購自北京酷來搏科技有限公司；RNA反轉錄、重組克隆試劑盒、高保真DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；qPCR 的專用試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

SD培養基(Synthetic Dropout Medium，SD)，酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPDA)，用于酵母繁殖和篩選；LB培養基用于大腸桿菌DH5α的培養。

1.2 重組誘餌載體pGBKT7- OsHDA703的構建

參照Clontech (Cat. No. 630489)方法進行酵母雙雜陽性對照和陰性對照的構建。703特異性引物，703-BK-F:5’-CATATGGCCATGGAGGCCATGGACCCCTCGT CGGCGGG-3’和703-BK-R:5’-CGCTGCAGGTCGACGGATTTTGGGTGAGCTTCCCGGTT-3’。以水稻日本晴14 d苗為材料，采用Trizol法提取總RNA[11]，并參照逆轉錄試劑盒說明制備cDNA。并參照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase說明書，以cDNA為模板，擴增OsHDA703基因全長序列；使用BamHI和EcoRI對質粒pGBKT7進行雙酶切后與擴增的OsHDA703基因全長序列進行進行重組反應，回收重組載體測序。對重組成功的質粒，轉入酵母，表達OsHDA703誘餌蛋白。

1.3 誘餌蛋白的自激活性檢測

將質粒pGADT7轉入酵母菌株Y187中，在其特征培養基SD(-Leu)上培養；pGBKT7- OsHDA703轉入酵母菌株Y2H Gold中，在其特征培養基SD(-Trp)上培養；隨后，各挑取1個SD(-Leu)和SD(-Trp)長出的單菌落于500 μL 2×YPDA液體培養基中混合培養12～15 h后，將菌液全部涂布在SD(-Trp/-Leu)培養基上培養，3 d后挑取能長出的單菌落重懸于100 μL無菌水中。稀釋10×或100×，分別吸取其10 μL菌液滴在SD(-Trp/-Leu)、SD(-Trp/-Leu/-His)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)固體培養基上培養3～5 d。結果觀察，如果在SD(-Trp/-Leu/-His)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)培養基上沒有菌落長出，說明誘餌蛋白pGBKT7- OsHDA703沒有自激活的特性。

1.4 水稻cDNA酵母文庫篩選

水稻cDNA酵母文庫篩選方法參照Clontech(Cat. No. 630489)稍有改進。挑取表達誘餌載體的酵母Y2H Gold單菌落(直徑2～3 mm)于50 mL的SD(/-Trp)液體培養基中，在30 ℃轉速220 r/min過夜培養至濃度OD600為0.8后，低速離心收集沉淀；然后用5 mL SD(/-Trp)液體培養基重懸沉淀獲得誘餌載體菌液(菌液濃度>1×108cfu/mL)。取1 mL酵母文庫菌液與5 mL誘餌載體菌液混合，加入50 mL的2×YPDA(含50 μg/mL卡那霉素)液體培養基，于3 L三角瓶中低速搖菌(50 r/min)進行結合培養。20 h后，取少量菌液在顯微鏡下觀察，如出現米老鼠狀酵母接合體，說明酵母接合雜交成功。隨后將菌液全部倒入50 mL離心管，低速離心收集沉淀。

取10 μL接合成功的酵母菌液，稀釋1 000后，取200 μL分別涂布在SD(-Leu)和SD(-Leu/-Trp)固體平皿上培養3 d根據生長出的菌落數計算結合效率，結合效率=酵母菌液在SD(-Leu/-Trp)培養基上長出的菌落數/酵母菌液在SD(-Leu)培養基上能長出的菌落數×100%。雜交效率大于2%即為合格。剩余49.9 mL菌液全部均勻涂布在62個SD(-Trp/-Leu/-His)固體培養基上，每個平皿800 μL；挑取長出2～3 mm大小的單菌落重懸于10 μL無菌水中，滴在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)培養基上培養3～5 d后挑取正常生長的菌落即為可能互作的結合子。

隨后，為擴繁質粒數量，提取酵母質粒，應用熱激法將酵母質粒轉化大腸桿菌菌株DH5α，使用含有氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的LB培養基篩選抗Amp的菌株；使用pGADT7通用引物(T7：5’-TTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)對抗性菌株的質粒進行測序。測序結果進行互作基因的鑒定及功能預測。

1.5 互作基因鑒定及功能預測

將測序結果，在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)網站上使用Blast X功能進行序列比對，找到相近基因序列；隨后在水稻基因組注釋平臺RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)網站上查找水稻相應基因序列、名稱及功能。同時，使用Vector NTI軟件篩除假陽性克隆。

1.6 RSV侵染前后互作基因的表達變化分析

使用NCBI的Primer-BLAST功能對每個酵母雙雜篩選出來的互作基因進行引物設計，引物序列見表1。參照Hu等[12]的方法制備帶毒水稻和不帶毒水稻，采用Trizol法提取總RNA后制備cDNA。以此cDNA為模板，參照SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit說明書，檢測互作基因在水稻病毒侵染前后的表達變化。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

2 結果與分析

2.1 OsHDA703誘餌蛋白表達載體的構建及序列測定

如圖1，特異引物從水稻cDNA中擴增的OsHDA703基因片段全長為1 533 bp。隨后將OsHDA703片段與質粒pGBKT7進行重組，獲得重組質粒pGBKT7-OsHDA703。使用特異引物HD-820F:5’-TCCTGGTGCAGTCGTGCTTCA-3’檢測重組質粒，發現重組載體的前672位堿基與OsHDAC703 cDNA序列上第859～1 530位堿基完全相同，重組載體的后78位堿基與載體pGBKT7BamHI酶切位點后的78個堿基相同，說明BamHI酶切位點接口連接無誤，進而表明OsHDA703已經成功構建在酵母載體上。

圖1 OsHDA703基因的PCR產物Fig.1 PCR products of OsHDA703

2.2 誘餌蛋白自激活性檢測

如圖2，含有pGADT7酵母菌株Y187和含有pGBKT7- OsHDA703的酵母菌株Y2H Gold經混合中培養3 d后，發現在SD(-Trp/-Leu)固體培養基上有菌落長出，說明酵母接合雜交成功；而在SD(-Trp/-Leu/-His)、SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)固體培養基上無菌落生長，說明pGBKT7-OsHDA703不具有自激活性，可以進行后續互作蛋白的篩選。

圖2 誘餌蛋白自激活性檢測Fig.2 Autoactivation test of bait protein

2.3 酵母文庫篩選OsHDA703互作蛋白的結果

酵母文庫與誘餌載體混合培養后的菌液經40倍鏡檢，觀察到了米奇頭狀酵母接合體(圖3A)，說明誘餌與文庫中的蛋白接合雜交成功。結合后的酵母菌液在SD(-Leu)培養基上能長出約225個菌落(圖3B，每個菌落2～3 mm)，而在SD(-Leu/-Trp)培養基上長出約20個單克隆菌落，雜交率為8.9%，滿足酵母雙雜交文庫篩選所需2%的雜交效率。

注：A酵母接合體；B計算接合率的酵母培養Note: A yeast zygotes; B yeast culture for calculating mating efficiency圖3 酵母接合體及接合率的計算Fig.3 Yeast zygotes and calculation of mating efficiency

在此基礎上，將剩余49.9mL菌液全部均勻涂布于62個SD(-Trp/-Leu/-His)平皿上進行初次篩選(圖4A)，獲得長勢最接近陽性對照(圖4B)的單菌落1 068個。隨后在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His) 平皿上再次篩選，得到56個互作較強的酵母接合體，經測序檢測后得到20個未移碼的陽性克隆，14個非重復的候選基因序列，表明篩選得到14個與OsHDA703互作的蛋白。

注： A 酵母接合子初選結果；B 上排pGBKT7-53+pGADT7-T為陽性對照，下排pGBKT7-Lam+pGADT7-T為陰性對照Note: A Primary screening of yeast zygotes; B The upper row: pGBKT7-53+pGADT7-T served as positive control; the lower row： pGBKT7-Lam+pGADT7-T served as negative control圖4 酵母接合子初選結果與對照Fig.4 Screening of yeast zygotes and control

經NCBI序列比對，及在Rice Genome Annotation Project網站上查找的水稻相應基因序列、名稱及功能，經酵母雙雜篩選出來14個與OsHDA703互作的蛋白，見表2，其中 1個為線粒體蛋白COX11(LOC_Os03g50940)、1個為翻譯因子EF-Tu(LOC_Os03g08020.1)、5個為葉綠體蛋白(LOC_Os05g33510、LOC_Os06g01210、LOC_Os07g37030.1、LOC_Os02g22260.1、LOC_Os05g36000.1)、1個為轉座子蛋白(LOC_Os04g55710.1)、2個為核蛋白ZF-HD和DIP1(LOC_Os12g10630、LOC_Os05g34070.1)、1個為Cupin超家族蛋白酶(LOC_Os04g36760.1)、1個為內參基因編碼蛋白(LOC_Os01g64630)和2個未知功能蛋白(LOC_Os02g40260、LOC_Os11g38040)。

2.4 互作蛋白在RSV侵染水稻前后基因表達變化分析

對酵母雙雜篩選出來的14個互作蛋白的基因表達分析發現(圖5)，RSV侵染后，誘導OsHDA703表達量上調，1號和5號基因(基因位點見表2)亦表達上調，2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13和14號基因表達下調。說明RSV侵染誘導OsHDA703、1號和5號基因的表達，而抑制了其他基因對的表達。

表2 與OsHDA703互作蛋白的基因功能分析Tab.2 Gene function analysis of interacting protein with OsHDA703

1號蛋白推測可能是位于細胞核中的鋅指蛋白，有報道認為鋅指蛋白作為在真核生物細胞核中穩定存在的、擁有DNA結合結構域的蛋白，可以單獨或與其他蛋白形成復合體，在轉錄過程中以及植物對生物和非生物脅迫的應急反應中發揮作用[13]；

而5號是轉座子蛋白，定位于線粒體。之前的研究發現OsHDA703定位于細胞核[9]，但是OsHDA703是否也在其他細胞器中表達還沒有研究。因此推測1號和5號蛋白都有可能與OsHDA703互作，參與植物抗RSV免疫反應。

注：A 細胞核中互作基因；B質體中互作基因和未知基因；C 線粒體中互作基因；D OsHDA703Note: A Interacting genes in nucleus; B Interacting genes in plastid genes andunknown genes; C Interacting genes in mitochondrial; D OsHDA703圖5 水稻侵染前后互作基因的表達分析Fig.5 Expression analysis of interaction genes before and after RSV infection in Rice

3 討 論

酵母雙雜交這一方法在很多蛋白互作研究中被報道使用，目前國內外關于RSV和組蛋白去乙酰化酶之間的調控機制，以及蛋白互作的研究報道較少。本研究采用酵母接合型雙雜交系統篩選與OsHDA703互作的蛋白，結果酵母接合效率約為8%，高于試驗所要求的最低值2%。

本研究通過雜交篩選后，得到了14個可能與OsHDA703互作的蛋白，包括2個未知蛋白和12個可查詢的蛋白。這12個蛋白根據分布位置分為3個細胞核蛋白、2個線粒體蛋白和7個質體蛋白。

已有研究證明本實驗中篩選到的一些蛋白會參與植物免疫反應。水稻擬禾本科根結線蟲在侵染水稻根部時會分泌一種效應子Mg16820，通過酵母雙雜交系統篩選，及植物體內雙分子熒光互補鑒定，發現其與，DIP1(3號基因)產生互作[14]；而在玉米中，干旱脅迫或脫落酸處理都會誘導DIP1參與rab17途徑[15]。在棉花中發現的GhABP19蛋白，作為屬于Cupin超家族的水溶性植物糖蛋白(9號基因)，會調控茉莉酸介導的信號傳導，和超氧化物歧化酶活性，參與棉花抗黃萎病和枯萎病的免疫反應[16]；在檸檬中，FabA基因(8號基因)會在C16和C18脂肪酸積累中的表達，從而參與油斑病的抗性調控[17]。因此推測這些蛋白可能與OsHDA703互作，參與植物抗RSV。根據已有研究發現，本研究中篩選出的7個質體蛋白和2個線粒體蛋白中一些蛋白已經被證實了可以參與植物抗病免疫，并且OsHDA703的同源蛋白OsHDA710可以定位在細胞核及細胞質[18]，因此推測OsHDA703也可能會參與調控葉綠體、線粒體蛋白乙酰化、光合作用、電子傳遞、植物脂肪酸合成、植物激素水平變化等途徑，最終影響水稻抗RSV。

綜上所述，本研究利用酵母雙雜交系統篩選出14個可能與OsHDA703互作的蛋白，為研究OsHDA703參與抗病免疫機制提供理論基礎，之后需要在植物體內進行雙分子熒光互補、免疫共沉淀等試驗進行進一步驗證。