超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水中喹諾酮類抗生素的研究

李志廣

摘要：喹諾酮類抗生素是一種經(jīng)過人工合成的抗菌藥物，除了作為醫(yī)療藥物使用以外，它還主要被當(dāng)作畜牧業(yè)飼料的添加成分，目的是提高飼料的有效利用率以及畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物的抗病害能力。以往傳統(tǒng)的免疫法測(cè)定喹諾酮類抗生素的水質(zhì)檢測(cè)技術(shù)不僅測(cè)定周期長(zhǎng)，且極容易因不確定的外部環(huán)境因素影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。基于此，對(duì)一種基于固相萃取檢測(cè)的液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定法，在水中喹諾酮類抗生素測(cè)定試驗(yàn)上的應(yīng)用進(jìn)行理論講解。希望通過此文可以為水質(zhì)檢測(cè)部門，在畜牧業(yè)污水質(zhì)量測(cè)定上提供一定的理論幫助。

關(guān)鍵詞：喹諾酮類抗生素;固相萃取;三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用

1.????????????? 試驗(yàn)前期準(zhǔn)備

1.1試驗(yàn)儀器

考慮到畜牧業(yè)污水的化合基質(zhì)成分比較復(fù)雜，為了可以獲得遠(yuǎn)高于單四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的信噪比，儀器選用型號(hào)為Agilent 7000B GC/MS Triple Quad的液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，這種儀器可以在背景樣品中對(duì)水中喹諾酮類抗生素的目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性定量，質(zhì)量穩(wěn)定性水平在±0.1m/z以內(nèi)，信噪比大于180：1，檢測(cè)限的精度等級(jí)上基本達(dá)到了飛克標(biāo)準(zhǔn)，配套色譜柱規(guī)格為21mm*50mm，φ1.7μm。

除了儀器之外，試驗(yàn)中還準(zhǔn)備了SPE固相萃取儀，電源電壓220V，頻率50Hz，儀器配備通道數(shù)量5條，單條通道流速≤16.10ml/min，樣品泵管轉(zhuǎn)速100rpm，萃取準(zhǔn)確度為2.5%，儀器運(yùn)行檔位有三個(gè)，分別為流量檔位、液量分配檔位和時(shí)間節(jié)點(diǎn)檔位，儀器輸入閥值為100psi，輸出閥值為30psi。

NAI-DCY-12ZG自動(dòng)型干式氮吹儀，配備12孔圓形水浴，借助儀器配套自帶的Product description軟件，可以將氮吹儀運(yùn)行示數(shù)在前端操作面板上以可視化的數(shù)字顯示形式呈現(xiàn)。

1.2材料準(zhǔn)備

水中喹諾酮類抗生素測(cè)定試驗(yàn)中主要使用如下幾類化學(xué)藥劑：工業(yè)優(yōu)級(jí)純度氫氧化鈉固體;工業(yè)優(yōu)級(jí)純度稀硫酸溶液;色譜純度乙腈;NOR、OFL、ENR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);蒸餾提純過的去離子水。

2.????????????? 儀器分析條件

在進(jìn)行實(shí)際測(cè)定之前，首先應(yīng)當(dāng)利用甲醇溶液對(duì)測(cè)試樣本進(jìn)行定性處理，將甲酸溶液與甲醇溶液分別梯度洗脫至80%與15%，洗脫時(shí)間設(shè)置為5min后，采用正乙烷作為無水有機(jī)溶液將兩份樣本進(jìn)行定容。而后在將兩組不同洗脫度的溶液裝進(jìn)3個(gè)樣本泵管中進(jìn)行實(shí)際測(cè)試，收集儀器的采集信號(hào)，直至三組泵管樣本定量的平行性符合儀器測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

3.????????????? 固相萃取樣品制配

將待測(cè)定的水質(zhì)樣本裝入固相萃取樣本柱管內(nèi)，首先加入6ml乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）溶液，它是固相萃取中用于配位滴定的配合物。而后再向樣本柱管內(nèi)通入6ml二氯甲烷進(jìn)行活化，靜置5min后加入6ml甲醇溶液標(biāo)定。而后調(diào)整固相萃取樣本的pH值，使送樣可以通過固相萃取儀的富集柱管。在固相萃取儀中完成富集過程后，將柱管安置于氮吹儀的水浴孔上進(jìn)行至少20min的氮吹，而后用10ml的洗脫液將水質(zhì)樣本的待檢測(cè)物轉(zhuǎn)移至洗脫液內(nèi)，收集洗脫液并氮吹至全干，最后用初始流動(dòng)相將固相萃取樣本進(jìn)行定容制樣。在固相萃取樣本的制配工序中，最后過孔徑為0.2μm的膜時(shí)送樣中不能含有無機(jī)酸、鹽與水分。

4.????????????? 測(cè)定方法的檢出限

首先在對(duì)實(shí)際送檢水樣進(jìn)行喹諾酮類抗生素測(cè)定前，應(yīng)當(dāng)先以喹諾酮類抗生素為檢出相，制配喹諾酮類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將試驗(yàn)前準(zhǔn)備濃度為100mg/L的喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加入制配比例為15：89的甲醇-甲酸比例溶液，，標(biāo)準(zhǔn)溶液中喹諾酮類抗生素含量為100μg/L。而后將上述溶液分別在萃取儀與聯(lián)用儀上實(shí)際測(cè)試，得到分析結(jié)果，固相萃取樣本導(dǎo)柱中的離子反應(yīng)面積越大

，則說明送檢樣本的配喹諾酮類抗生素含量越高，而通過計(jì)算在色譜樣本中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)離子反應(yīng)程度，就可以直接推算出這種四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法的檢出限。

5.????????????? 測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

得出三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法的最低檢出限后，首先向裝有去離子水的空白樣本加入10μg標(biāo)準(zhǔn)溶液，而后再向裝有待測(cè)水樣的柱管內(nèi)加入100μg標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用外標(biāo)一點(diǎn)法對(duì)樣本進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定。這種方法思路是利用空白樣本中加入喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的對(duì)照品溶液濃度，對(duì)比測(cè)定出待檢水樣中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量，在Agilent 7000B GC/MS Triple Quad液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)行不少于5次的多次進(jìn)樣，通過可視化屏幕得出對(duì)照品溶液與待測(cè)樣本溶液的峰面積，進(jìn)而推算出待測(cè)水樣中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量濃度。被測(cè)水樣的濃度計(jì)算公式為如下：

其中Wi表示為被測(cè)水樣中含有喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度含量;Ai表示為對(duì)照樣本中含有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度含量;（Wi）s與（Ai）a分別表示為在樣本柱管中相同進(jìn)量體積的被測(cè)樣本與對(duì)照樣本中含有純品喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的組分重量，用樣本峰面積來表達(dá)。為了降低外標(biāo)定量法的誤差影響，試驗(yàn)中選擇將5組聯(lián)用儀的進(jìn)樣示數(shù)，去除最高值與最低值后，進(jìn)行平均值計(jì)算。得出被測(cè)水樣如下加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

原被測(cè)水樣中NOR物質(zhì)的測(cè)定值為7.4μg/L，樣本加標(biāo)質(zhì)量為10μg，平均回收率為92.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為8.7%;OFL物質(zhì)測(cè)定值為1.5μg/L，樣本加標(biāo)質(zhì)量為100μg，平均回收率為93.1%，RSD偏差為8.1%;ENR物質(zhì)測(cè)定值為1.6μg/L，樣本加標(biāo)質(zhì)量為10μg，平均回收率為87.5%，RSD偏差為9.9%。

結(jié)語：綜上所述，采用超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用法，進(jìn)行NOR、OFL與ENR三類喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量測(cè)定，可以在6min以內(nèi)得出被檢樣本中喹諾酮類抗生素物質(zhì)的含量分析數(shù)據(jù)，可以基本保證檢出限在0.3-0.7μg/L精度范圍之間，在測(cè)定試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)三種被測(cè)物質(zhì)的加標(biāo)回收率均在87.5%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于10%，測(cè)定精度符合飛克檢測(cè)限水平要求。借助聯(lián)用儀來進(jìn)行色譜-質(zhì)譜固相萃取比對(duì)的方法，不僅不需要傳統(tǒng)免疫法那樣較長(zhǎng)的樣本分析時(shí)長(zhǎng)，而且在測(cè)定精度上具有一定保障，且具有操作簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保的方案優(yōu)勢(shì)，因此可以被環(huán)保行業(yè)和相關(guān)水質(zhì)監(jiān)管部門廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)含喹諾酮類抗生素的水質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)目上。

參考文獻(xiàn)：

[1]孔瑜. β-內(nèi)酰胺類抗生素廢水有機(jī)物污染特征和篩查研究[D].上海第二工業(yè)大學(xué).

[2]于洋洋. 伊通河流域抗生素污染、微生物耐藥性及生物毒性研究[D].東北師范大學(xué).

[3]車先閣. 喹諾酮類抗生素殘留的三維熒光光譜檢測(cè)技術(shù)研究[D].燕山大學(xué).