羥基紅花黃色素A 腹腔注射對大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及其機制

王飛，喬櫟，劉建雄，張宏星

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州730030；2 甘肅省人民醫(yī)院神經(jīng)外科

缺血性腦卒中是危害人類健康的常見疾病之一，其致殘率及致死率較高。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HYSA）是從紅花的主要成分紅花黃色素中提取的含量最高的單體，極性較強，是治療缺血性疾病療效顯著的中草藥。研究［1-4］發(fā)現(xiàn)，HYSA 在心肌缺血再灌注損傷、抗癌、抗凝血方面具有良好的治療作用。2005 年，HYSA 被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準用于急性心肌梗死、冠心病、心絞痛等心臟病患者的治療。研究［5］發(fā)現(xiàn)，銀杏葉中提取的銀杏素可以減少腦缺血再灌注損傷大鼠的凋亡細胞數(shù)量，其可通過下調(diào)Caspase-3 和Bax 的水平以及上調(diào)Bcl-2 的水平抑制大鼠細胞凋亡來拮抗腦缺血再灌注的損傷。研究［6］發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血區(qū)域c-fos 基因表達升高可通過減少細胞凋亡，從而改善大鼠腦缺血后的功能。丁苯酞的主要化學(xué)成分是3-丁基-1（3H）-異苯并呋喃酮，在中國已被批準用于治療缺血性腦卒中，療效確切。研究［7］發(fā)現(xiàn)，丁苯酞可上調(diào)Bcl-2 蛋白表達和下調(diào)Bax、Caspase-3 蛋白表達，通過抗凋亡機制對腦缺血再灌注損傷起顯著的神經(jīng)保護作用。2021年1—9月，我們觀察了腹腔注射對大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1. 1 大鼠、藥品、試劑及儀器 SPF 清潔級雄性SD大鼠60只購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（甘）2020-0001，動物質(zhì)量合格證號：NO. 62001000000584，體質(zhì)量250～280 g，飼養(yǎng)在清潔、安靜、通風(fēng)良好的環(huán)境中，自由進食、飲水。實驗大鼠經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)機構(gòu)動物護理和使用委員會批準。丁苯酞軟膠囊（0. 1 g/粒）購自甘肅省人民醫(yī)院藥劑科。羥基紅花黃色素A，批號：34512，分析標準品≥98%。Bax 抗體、Bcl-2 抗體、Caspase-3 抗體和c-fos 抗體抗體均購自美國Immunoway 公司。JB-P5 包埋機購自俊杰電子有限公司，RM2016 病理切片機購自上海萊卡儀器有限公司，BX53 奧林巴斯顯微拍照系統(tǒng)購自O(shè)LYMPUS 公司，Western blotting 儀器全套購自伯樂生物科技公司，MiniChemi 610 化學(xué)發(fā)光成像儀購自北京六一生物科技有限公司，Quantstudio 3 熒光定量PCR 儀購自Thermofisher 公司，ABI-9700PCR 擴增儀購自Applied biosystems 公司，11141-C 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海翊圣公司。

1. 2 大鼠分組、HYSA 腹腔注射及腦缺血再灌注處理方法 60 只SD 大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、丁苯酞組、低劑量HYSA 組、高劑量HYSA 組，每組12 只。假手術(shù)組、模型組給予腹腔注射0. 9% NaCl溶液，劑量為1. 0 mL/kg；丁苯酞組給予腹腔注射丁苯酞軟膠囊混懸液（0. 1 g 丁苯酞軟膠囊溶解于100 mL tween80 溶液中，濃度為1 mg/mL），劑量為80 mg/kg；低劑量HYSA組給予腹腔注射5. 0 mg/mL的HYSA，劑量為1. 0 mL/kg；高劑量HYSA 組給予腹腔注射10. 0 mg/mL 的HYSA，劑量為1. 0 mL/kg；大鼠均腹腔注射每天1 次，連續(xù)5 d。各組大鼠腹腔注射5 d 后，模型組、丁苯酞組、低劑量HYSA 組、高劑量HYSA 組參照文獻［8-9］使用小修正方法進行腦缺血再灌注處理，假手術(shù)組不插線栓，其余過程相同。

1. 3 各組大鼠神經(jīng)功能評分 各組大鼠處理完畢后清醒4 h，采用Longa 評分法對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分。無神經(jīng)功能損傷記0 分，不能完全伸展對側(cè)前爪記1 分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記2 分，向?qū)?cè)傾倒記3分，不能自發(fā)行走或意識喪失記4分。

1. 4 各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察 采用HE 染色法。處理完畢后，每組取5 只大鼠，采用5% 水合氯醛麻醉，快速開胸，用4% 多聚甲醛200 mL心臟灌注后，斷頭取腦，取缺血部位腦組織置于4% 多聚甲醛液中固定，由低濃度到高濃度乙醇梯度脫水1 h，二甲苯透明20 min，浸蠟后包埋組織，蠟塊室溫冷卻后以4 μm 厚度切片，37 ℃烘干切片后，二甲苯脫蠟，高濃度到低濃度乙醇脫水并水洗，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，伊紅染色，高濃度乙醇脫水，二甲苯浸泡5 min，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。

1. 5 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos mRNA 檢測 采用RT-qPCR 法。處理完畢后，每組取7 只大鼠，5% 水合氯醛麻醉，斷頭法處死，取缺血再灌注區(qū)皮層組織，置于-80 ℃冰箱里保存。取缺血再灌注區(qū)皮層組織，研磨、勻漿，按TRLzol 法常規(guī)提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR 擴增。Bax 引 物 上 游 序 列 為 5′-GAACCATCATGGGAAAGGACA-3′，下 游 序 列 為5′-GGTCCATCATGGAAAGGA-3′；Bcl-2 引 物 上 游 序 列 為5′-CCAGCATGCGACCTCTGTTT-3′，下 游 序 列 為5′-CTCACTTGTGGCCCAGGTAT-3′；Caspase-3 引 物上 游 序 列 為5′-GAGCTTGGAACGCGAAGAAA-3′，下游序列為5′-GAGTCCATCGACTTGCTTCCA-3′；c-fos 引物上游序列為5′-CGGGTTTCAACGCGGACTAC-3′，下游序列為5′-GTTGGCACTAGAGACGGACAGA-3′；GAPDH 引物上游序列為5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列為5′-ACGCCAG-TAGACTCCACGACAT-3′。擴增產(chǎn)物采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描、分析，以GAPDH 為參照，以2-ΔΔCt表示腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos mRNA 的相對表達量。

1. 6 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos蛋白檢測 采用Western Blotting 法。取梗死區(qū)周邊腦組織，以組織裂解液提取組織蛋白，4 ℃條件下以12 000 r/min 離心15 min 后收集上清液，以BCA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量。取蛋白30 μg，與上樣緩沖液混合后，行十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，并于電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素酶膜上，以5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）和c-fos（1∶1 000）抗體一抗和內(nèi)參GAPDH（1∶1 000），于4 ℃孵育過夜；用TBST 溶液清洗10 min，清洗3次，加入抗兔IgG 二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，用TBST 溶液清洗10 min，清洗3 次，以ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色后置于蛋白電泳系統(tǒng)及凝膠成像儀上成像，使用Image J 軟件處理，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1. 7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25. 0 統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以-x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。P＜0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 假手術(shù)組、模型組、丁苯酞組、低劑量HYSA 組、高劑量HYSA 組大鼠神經(jīng)功能評分分別為0、（2. 75 ± 0. 50）、（1. 75 ±0. 50）、（2. 00 ± 0. 81）、（1. 75 ± 0. 50）分，其中假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能未受損，模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著高于其余各組（P均＜0. 05），高劑量HYSA組、丁苯酞組大鼠神經(jīng)功能評分顯著低于低劑量HYSA組（P均＜0. 05）。

2. 2 各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化 各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化見圖1。由圖1可見，假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)無異常，細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞核形態(tài)正常，染色質(zhì)均勻；模型組大鼠腦組織細胞間隙明顯增大，細胞核減少且深染，細胞形態(tài)不規(guī)則；低劑量HYSA組較模型組細胞形態(tài)有一定改善，但部分細胞核仍濃縮深染；高劑量HYSA 組和丁苯酞組與模型組相比，細胞壞死明顯改善，細胞形態(tài)恢復(fù)正常，細胞排列整齊。

2. 3 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos mRNA 的相對表達量比較 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos mRNA的相對表達量比較見表1。由表1 可知，模型組大鼠腦組織中Bax、Caspase-3、c-fos mRNA 的相對表達量顯著高于其余各組（P均＜0. 05），Bcl-2 mRNA的相對表達量顯著低于其余各組（P均＜0. 05）；高劑量HYSA組、丁苯酞組大鼠腦組織中Bax、Caspase-3、c-fos mRNA 的相對表達量顯著低于低劑量HYSA 組（P均＜0. 05），Bcl-2 mRNA 的相對表達量顯著高于低劑量HYSA組（P均＜0. 05）。

表1 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-os mRNA的相對表達量比較（-x±s）

2. 4 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos蛋白相對表達量比較 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos蛋白的相對表達量比較見表2。由表2可知，模型組大鼠腦組織中Bax、Caspase-3、c-fos蛋白的相對表達量顯著高于其余各組（P均＜0. 05），Bcl-2 蛋白的相對表達量顯著低于其余各組（P均＜0. 05）；高劑量HYSA 組、丁苯酞組大鼠腦組織中Bax、Caspase-3、c-fos 蛋白的相對表達量顯著低于低劑量HYSA 組（P均＜0. 05），Bcl-2 蛋白的相對表達量顯著高于低劑量HYSA 組（P均＜0. 05）。

表2 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos蛋白的相對表達量比較（-x±s）

3 討論

腦卒中被認為是導(dǎo)致死亡和神經(jīng)功能障礙的主要原因，病理生理機制復(fù)雜，其中凋亡和自噬在腦缺血中扮演著重要的作用［10］。缺血性腦卒中一旦發(fā)生會使暗帶區(qū)的自噬和凋亡激活［11］，且近期研究發(fā)現(xiàn)自噬和凋亡在大鼠腦缺血再灌注后12 h 被激活，在亞急性期存在凋亡到自噬的狀態(tài)轉(zhuǎn)換［12］，因此通過干預(yù)腦缺血再灌注損傷時細胞凋亡可對腦神經(jīng)起保護作用，從而阻止發(fā)生缺血性腦卒中后神經(jīng)功能障礙。Bax是促凋亡基因，Bcl-2位于線粒體外膜，通過抑制內(nèi)源性途徑阻止細胞凋亡抗凋亡基因，在外界不同因素的刺激下，這兩種蛋白通過細胞內(nèi)線粒體蛋白釋放，共同作用于細胞的凋亡過程［13］。Caspase-3 參與細胞凋亡程序，抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表達增加和促凋亡因子Bax 蛋白表達減少可激活Caspase-3 凋亡信號通路［14］。c-fos 基因的啟動子區(qū)域有與Jun 通過亮氨酸拉鏈結(jié)合成異源二聚體AP-復(fù)合體的AP-1結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)細胞凋亡［15］。

HYSA 是治療缺血性疾病療效顯著的中草藥，HYSA 對心腦血管疾病的治療作用主要在于其通過作用于復(fù)雜的信號通路而發(fā)揮抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護作用［16］。研究［17］顯示，HYSA 治療心臟缺血再灌注損傷時，可通過減少Caspase-3蛋白的表達及降低促凋亡蛋白Bax 的表達對心臟細胞起保護作用，且HYSA 還有抗腦缺血的功效。研究［18］發(fā)現(xiàn)，HYSA通過抑制線粒體通透性過渡孔的凋亡來減輕腦缺血再灌注損傷。目前對于HYSA 對于抗腦缺血的研究暫無明確機制，本文通過探究HYSA 對凋亡過程中Caspase-3、Bax、Bcl-2、c-fos 的影響，為臨床上HYSA治療腦缺血再灌注損傷提供更多的理論基礎(chǔ)。

研究［19-20］發(fā)現(xiàn)，丁苯酞目前在臨床上治療腦缺血再灌注方面效果確切，在腦缺血再灌注損傷方面主要通過減少Caspase-3 mRNA 的表達起保護作用，丁苯酞還可通過抑制c-Jun N 端激酶（JNK）-Caspase3信號通路起作用，故本研究采用丁苯酞作為陽性藥物對照組。本研究通過構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，并在構(gòu)造模型前腹腔注射HYSA，結(jié)果表明，神經(jīng)功能評分方面，高劑量HYSA 組與丁苯酞組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0. 05），與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0. 05），說明高劑量HYSA 在治療缺血性腦卒中和丁苯酞療效相當，同樣可以對腦缺血再灌注起預(yù)防作用。在大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化方面可見，高劑量HYSA 組和丁苯酞組與模型組相比，細胞壞死明顯改善，細胞形態(tài)恢復(fù)正常，亦說明HYSA 對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞起預(yù)防作用。在模型組中，大鼠缺血灌注損傷可以上調(diào)Bax、Caspase-3、cfos mRNA 和蛋白表達，而下調(diào)Bcl-2 mRNA 和蛋白的表達；與模型組相比，通過腹腔注射HYSA 和丁苯酞均可以下調(diào)Bax、Caspase-3 和c-fos mRNA 和蛋白表達，上調(diào)Bcl-2 mRNA 和蛋白表達，因此HYSA 可能通過下調(diào)Bax、Caspase-3、c-fos mRNA 和蛋白表達和上調(diào)Bcl-2 mRNA 和蛋白表達從而減輕細胞凋亡；丁苯酞組與高劑量HYSA 組下調(diào)Bax、Caspase-3 和c-fos mRNA 和蛋白表達和上調(diào)Bcl-2 mRNA 和蛋白表達無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P均＞0. 05），因此臨床上治療缺血性腦卒中高劑量HYSA 和丁苯酞的療效可能相當，當然其機制是否相同這有待進一步研究。

綜上所述，高劑量（10. 0 mg/mL）HYSA 腹腔注射對大鼠腦缺血再灌注損傷有預(yù)防作用，與丁苯酞效果相當；HYSA 預(yù)防大鼠腦缺血再灌注損傷的作用機制可能與調(diào)節(jié)腦組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos的表達有關(guān)。本研究揭示了HYSA 對腦缺血再灌注的預(yù)防機制作用，可以為缺血性腦卒中的臨床治療提供新的實驗支持和理論依據(jù)。