金郁歡湯劑灌胃對(duì)抑郁癥小鼠抑郁樣行為的改善作用及其機(jī)制

劉宏，趙莉，張雨薇，仲麗麗，代巧妹，楊婧，李冀

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱150040；2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院；3 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

抑郁癥是一種常見的情感性精神障礙，它的主要臨床特征是持續(xù)抑郁、悲觀、對(duì)周圍環(huán)境缺乏興趣、睡眠障礙、精神和認(rèn)知延遲，甚至有自殺傾向［1］。西藥治療抑郁癥主要用以氟西汀為代表的5羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑等，其可選擇性地抑制5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體，阻斷突觸前膜對(duì)5-HT 的再攝取，延長(zhǎng)和增加5-HT 的作用，從而產(chǎn)生抗抑郁作用。但越來(lái)越多的證據(jù)［2］表明，應(yīng)用氟西汀治療抑郁癥可能會(huì)產(chǎn)生頭暈、震顫、認(rèn)知障礙、尿潴留和性功能障礙等不良反應(yīng)。抑郁癥在中醫(yī)學(xué)被稱為“郁證”，越來(lái)越多的研究［3-4］表明，中藥及其復(fù)方制劑在治療抑郁癥方面顯示出獨(dú)特的療效。中藥制劑不僅不良反應(yīng)少，而且療效可與化學(xué)藥物媲美，患者容易接受此類治療［5-6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致抑郁癥動(dòng)物模型大腦海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率上升，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少。本課題組前期對(duì)烏腺金絲桃單味藥的作用及其作用機(jī)理進(jìn)行了相關(guān)研究，證明烏腺金絲桃可改善慢性溫和不可預(yù)見性刺激（Chronic mild unpredictability stress，CMUS）大鼠的抑郁樣表現(xiàn)［8-9］。中藥金郁歡由烏腺金絲桃、郁金、合歡花三味中藥組成。其中烏腺金絲桃味苦性平，具清熱解毒、涼血止痛之功；郁金辛苦性寒，行氣解郁、涼血清心；合歡花味甘性平，安神解郁，三藥相伍，共奏清熱涼血、解郁安神之功。基于中醫(yī)對(duì)抑郁癥的認(rèn)識(shí)，2017 年1 月15 日—2019 年12 月24 日，我們利用CMUS 法［10］建立小鼠抑郁模型，觀察了金郁歡湯劑灌胃對(duì)抑郁癥小鼠抑郁樣行為的改善作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 小鼠、儀器、金郁歡湯劑制備 清潔級(jí)ICR 小鼠60只，體質(zhì)量（20 ± 2）g，鼠齡8～10周，雌雄不限。正常晝夜節(jié)律條件下飼養(yǎng)一周，自由進(jìn)食和飲水。R138 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司，JD-801 形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自捷達(dá)南京公司，PowerPacTMHC 電泳儀購(gòu)自Bio-rad公司，VE-180垂直電泳槽購(gòu)自天能公司，DY-B1 脫色搖床購(gòu)自上海青浦滬西儀器有限公司。金郁歡湯劑：取單味藥烏腺金絲桃60 g、單味藥郁金30 g、單味藥合歡花30 g，烏腺金絲桃與郁金、合歡花配伍比例為2∶1∶1，用水浸泡藥材2h，以藥材10 倍量的水進(jìn)行提取。鹽酸氟西汀（百憂解）購(gòu)自美國(guó)禮來(lái)制藥公司，在0. 5%羧甲基纖維素鈉水溶液中溶解成混合懸浮。

1. 2 抑郁癥模型小鼠的制備、分組及金郁歡湯劑給予方法 將60只ICR小鼠隨機(jī)分為control組、model組、JYH-L 組（金郁歡低劑量）、JYH-H 組（金郁歡高劑量）、fluoxetine 組（氟西汀），每組12只，其中model組、JYH-L 組、JYH-H 組、fluoxetine 組通過(guò)CMUS 法建立小鼠抑郁癥模型。CMUS法包括9種刺激方法，每天隨機(jī)選擇1種刺激，每天刺激的方法不同，連續(xù)4 周。具體刺激方法如下：①用水將墊料浸濕，使鼠籠潮濕24 h；②在4 ℃冰水中游泳3 min；③在56 ℃熱水中游泳3 min；④電擊小鼠足部10 s；⑤將小鼠放入一個(gè)通氣的透明瓶中禁錮其活動(dòng)，時(shí)間2 h；⑥禁食24 h；⑦傾斜鼠籠24 h；⑧禁水24 h；⑨用活頁(yè)夾夾尾2 min。造模完成后開始給藥，JYH-L 組小鼠給予金郁歡湯劑灌胃，金郁歡提取物劑量為0. 2 g/kg；JYH-H 組小鼠給予金郁歡湯劑灌胃，金郁歡提取物劑量為0. 8 g/kg；fluoxetine 組小鼠給予氟西汀懸浮液灌胃，氟西汀劑量0. 02 g/kg；control 組和model 組小鼠同期等體積生理鹽水灌胃；每日灌胃1次，連續(xù)3周。

1. 3 各組小鼠抑郁樣行為觀察 采用糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)觀察小鼠抑郁樣行為，以糖水偏嗜度表示。實(shí)驗(yàn)前對(duì)各組小鼠進(jìn)行蔗糖攝入訓(xùn)練：第1天，每只小鼠在單獨(dú)的籠子里喂養(yǎng)，并可以自由取水，提供兩瓶10% 蔗糖水，每瓶20 mL；第2天，將其中一個(gè)蔗糖水替換為一瓶20 mL 純凈水，水放在相同的容器里。蔗糖攝入訓(xùn)練后，小鼠禁水24 h。第4 天開始糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)：2 瓶包含20 mL 蔗糖水和20 mL 純凈水被放置在籠子里（每個(gè)瓶子的總重量測(cè)量前測(cè)試）。2 h 后，再次測(cè)量每瓶的重量（動(dòng)物的飲用量），并計(jì)算各組小鼠糖水偏嗜度。糖水偏嗜度=蔗糖水飲用重量/（蔗糖水飲用重量+ 純凈水飲用重量）×100%。1. 4 各組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、尼氏小體染色觀察及海馬CA1 區(qū)尼氏小體積分光密度（IOD）檢測(cè) ①采用Nissl染色法觀察小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、尼氏小體染色情況。每組取6只小鼠，10%水合氯醛溶液深麻醉后處死，獲取小鼠腦組織，PBS 沖洗后用500 mL 的4% 多聚甲醛溶液固定，在視神經(jīng)交叉后4 mm 處，即海馬平面做冠狀切片，大小1. 5 cm×1 cm×5 cm，4 ℃低溫固定48 h，石蠟包埋并5 mm切片，浸入1% 甲苯胺藍(lán)溶液中染色20 min，用蒸餾水快速?zèng)_洗并分化，蘇木精復(fù)染，脫水后清洗并安裝載玻片，光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、尼氏小體染色情況。②每組取1 張腦組織切片，每張切片選取10個(gè)不重疊連續(xù)高倍（×400）視野觀察，使用JD-801 形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)各組小鼠海馬CA1區(qū)尼氏小體IOD。

1. 5 各組小鼠海馬組織中散亂蛋白1（Dvl1）mRNA和蛋白檢測(cè) ①采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中Dvl1 mRNA。取小鼠海馬組織標(biāo)本，采用TRIzol-A + 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板、以GAPDH 為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Dvl1 mRNA 上游引物為5′-ATGAGGAGGACAATACGAGCC-3′，下 游 引 物 為5′-GCATTTGTGCTTCCGAACTAGC-3′。以2-ΔΔCt表 示 小 鼠 海 馬 組織中Dvl1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。②采用Western Blotting 法檢測(cè)各組小鼠海馬組織中Dvl1 蛋白。取小鼠海馬組織標(biāo)本，稱重后在冰上用高速攪拌器勻漿，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，收集上層清液，使用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物薄膜（PVDF），5%脫脂奶粉封閉1 h，加特異性抗體孵育，4 ℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 添加后在室溫下孵化2 h，加入ECL 液，以GAPDH 為內(nèi)參，用Image J 軟件進(jìn)行圖像處理后計(jì)算小鼠海馬組織中Dvl1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19. 0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以-x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni，s法。P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組小鼠抑郁樣行為比較 control 組小鼠糖水偏嗜度為4. 12% ± 0. 95%，model組小鼠糖水偏嗜度為2. 21% ± 0. 47%，兩組相比，P＜0. 05。 model組、JYH-L 組、JYH-H 組、fluoxetine 組小鼠糖水偏嗜度 分 別 為2. 21% ± 0. 47%、2. 60% ± 0. 59%、3. 70% ± 0. 42%、4. 00% ± 0. 36%，其中JYH-L 組、JYH-H 組、fluoxetine 組小鼠糖水偏嗜度與model 組相比，P均＜0. 05；JYH-H 組、fluoxetine 組小鼠糖水偏嗜度與JYH-L組相比，P均＜0. 05。

2. 2 各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、尼氏小體染色情況及海馬CA1區(qū)尼氏小體IOD值比較 各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、尼氏小體染色情況見圖1。由圖1 可見，與control 組相比，model 組神經(jīng)細(xì)胞排列松散或缺失，尼氏小體被輕微染色，甚至被溶解；與model組相比，JYH-L組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及尼氏小體染色上無(wú)顯著差別；與model 組相比，JYH-H 組與fluoxetine 組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列的更密集、更整齊，神經(jīng)細(xì)胞無(wú)核固縮深染現(xiàn)象，尼氏小體染色加深。control 組小鼠海馬CA1 區(qū)尼氏小體IOD 值為8 215. 96 ± 903. 58，model 組為3 025. 16 ± 898. 24，兩組相比，P＜0. 05。model 組、JYH-L 組、JYH-H 組、fluoxetine組小鼠海馬CA1區(qū)尼氏小體IOD值分別為3 025. 16 ± 898. 24、3 235. 28 ± 531. 11、6 915. 12 ±1 002. 36、7 238. 46 ± 1 302. 14，其 中JYH-H 組、fluoxetine 組小鼠海馬CA1 區(qū)尼氏小體IOD 值與model組、JYH-L組相比，P均＜0. 05。

2. 3 各組小鼠海馬組織中Dvl1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 control組小鼠海馬組織中Dvl1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為2. 02 ± 0. 11，model組為0. 97 ± 0. 04，兩組相比，P＜0. 05。model 組、JYH-L 組、JYH-H 組、fluoxetine 組小鼠海馬組織中Dvl1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0. 97 ± 0. 04、1. 06 ± 0. 03、1. 75 ± 0. 05、1. 75 ± 0. 11，其中JYH-H 組、fluoxetine 組小鼠海馬組織中Dvl1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與model 組、JYH-L組相比，P均＜0. 05。

control組小鼠海馬組織中Dvl1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1. 195 9 ± 0. 091 2，model組為0. 655 4 ± 0. 038 6，兩組相比，P＜0. 05。model 組、JYH-L 組、JYH-H 組、fluoxetine 組小鼠海馬組織中Dvl1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分 別 為0. 655 4 ± 0. 038 6、0. 771 4 ± 0. 082 6、1. 146 8 ± 0. 069 8、1. 560 7 ± 0. 059 5，其中JYH-H組、fluoxetine 組小鼠海馬組織中Dvl1 蛋白相對(duì)表達(dá)量與model組、JYH-L組相比，P均＜0. 05。

討論

抑郁癥是一種復(fù)雜的疾病，影響某些神經(jīng)系統(tǒng)組成部分［11］。經(jīng)典的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)認(rèn)為，抑郁癥的發(fā)生主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（A）的減少有關(guān)［12］。DVL1 是一種75 kD 的多結(jié)構(gòu)域蛋白［13］，通過(guò)特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)典型和非典型Wnt 信號(hào)［14］。Wnt/β-catenin 通路，是目前研究較深入的途徑［15］。DVL1蛋白是Wnt信號(hào)通路的中心介體，它的典型作用是在細(xì)胞質(zhì)中促進(jìn)β-catenin 的穩(wěn)定［16］。有研究［17］發(fā)現(xiàn)，抑郁小鼠DVL 水平下調(diào)，而且在死后抑郁癥患者的N-乙酰-L-半胱氨酸中也得到了證實(shí)。西醫(yī)抗抑郁藥物療效不佳且不良反應(yīng)大［18］，常見的不良反應(yīng)包括戒斷反應(yīng)、性功能障礙和體質(zhì)量增加［19］、情緒麻木、睡眠相關(guān)運(yùn)動(dòng)障礙、震顫和異常出血［20］等，為了使抑郁患者得到更好的療效，我們做了對(duì)中藥金郁歡的初步研究。

目前藥物治療是治療抑郁癥的主要方法［21］。傳統(tǒng)的單一靶點(diǎn)抗抑郁藥物療效不理想，中醫(yī)藥一直被用來(lái)治療抑郁癥［22］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論對(duì)抑郁癥具有獨(dú)特的認(rèn)識(shí)和較完整的治療體系，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診療手段相結(jié)合，在抑郁癥的治療領(lǐng)域中可發(fā)揮一定的優(yōu)勢(shì)。藥理研究［23］發(fā)現(xiàn)，烏腺金絲桃可用于治療抑郁癥。有研究［24］認(rèn)為，合歡花具有鎮(zhèn)靜催眠作用。對(duì)抗抑郁中藥處方進(jìn)行藥物篩選發(fā)現(xiàn)，郁金是抗抑郁處方的核心藥物之一［25］。本研究將烏腺金絲桃、郁金、合歡花、三藥合用，取名金郁歡，希望可以增強(qiáng)療效。

為了研究金郁歡的抗抑郁作用，本研究采用CMUS 法建立小鼠抑郁癥模型，用金郁歡對(duì)小鼠抑郁癥模型進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)Nissl染色觀察小鼠海馬組織損傷程度，進(jìn)而觀察金郁歡湯劑的治療作用。本研究結(jié)果顯示，與control 組相比，model 組小鼠糖水偏嗜度顯著下降；與model 組相比，JYH-L 組、JYH-H組糖水偏嗜度顯著增加，說(shuō)明金郁歡對(duì)抑郁小鼠有一定的治療作用。Nissl 染色結(jié)果顯示，model 組神經(jīng)細(xì)胞在海馬CA1 區(qū)排列松散或缺失。海馬是產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的重要區(qū)域［26］，這一組織損傷是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一［27］。有研究［28］表明，抗抑郁藥的治療可以改善海馬結(jié)構(gòu)的損傷。本研究也表明JYH-L組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及尼氏小體染色上無(wú)顯著差別，但JYH-H組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列的更密集、更整齊，說(shuō)明了金郁歡可以改善抑郁小鼠的海馬結(jié)構(gòu)。Western Blotting 法、RT-PCR 法檢測(cè)都顯示，model 組小鼠海馬組織中Dvl1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量都明顯下降，而JYH-H 組小鼠海馬組織中Dvl1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，小鼠抑郁行為顯著改善。

綜上，金郁歡可以提高抑郁動(dòng)物模型的糖水偏嗜度，保護(hù)小鼠海馬組織，發(fā)揮了抗抑郁的功效，其中低劑量金郁歡效果不明顯，高劑量效果顯著，我們推薦劑量為高劑量。金郁歡的這種功效可能通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)，調(diào)節(jié)DVL1 的表達(dá)可能是其機(jī)制之一，進(jìn)一步的機(jī)制有待研究。