追寄蠅寄生對家蠶齡期經過的影響及其機制＊

顧欣然，代敏麗，王遐坤，仲思銀，李 兵，衛 靜，2＊

（1. 蘇州大學 基礎醫學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123；2. 福建農林大學 植物保護學院，福建 福州 350002）

雙翅目寄蠅（Tachinidae）作為自然界中僅次于膜翅目寄生蜂的第二大類群寄生性昆蟲，在害蟲種群控制和維持生態平衡方面具有重要的作用，目前全世界已記載的寄蠅有1477屬8592種[1，2]。寄蠅是農林牧業害蟲生物防治的重要天敵資源，被廣泛應用于害蟲如松毛蟲、粘蟲等的生物防治[3，4]。同時，部分寄蠅也是危害經濟昆蟲家蠶（Bombyx mori）和柞蠶（Antheraea pernyi）的主要害蟲[5，6]。

家蠶是重要的經濟昆蟲，也是國際無脊椎動物協會確定的鱗翅目模式昆蟲[7]。生產上對家蠶和柞蠶危害最大的是追寄蠅（寄蠅科、追寄蠅屬）和飾腹寄蠅（寄蠅科、飾腹寄蠅屬）[8]。它們屬于完全變態昆蟲，幼蟲期包括3個齡期，雌蠅將尚未完成胚胎發育的卵產于寄主體表或食料植物上，幼蟲在寄主體表或消化道內孵化后鉆入寄主體腔內，3 齡幼蟲末期鉆出寄主化蛹[9]。目前蠶業生產上防治寄蠅主要利用“滅蠶蠅”對家蠶進行添食或體外噴施，而寄蠅已對該藥物產生了抗性，防治效果逐漸下降，有研究表明在長期廣泛使用“滅蠶蠅”的地區的蠅蛆抗藥性可達極少使用該藥地區的3.32 倍[10]。目前關于追寄蠅的了解多在其生物生態學特性與寄生規律上[5，11，12]，研究多集中在生物防治方面，而對追寄蠅寄生后家蠶的生長發育和二者互作的分子機制研究較少，這大大制約了蠶業生產中追寄蠅防控技術和藥物的開發。

已有研究表明，家蠶追寄蠅偏向于寄生末齡家蠶幼蟲，寄生率達48%，因而其對大蠶期（末齡期家蠶）危害較大[13]。寄生不僅可激活家蠶的免疫反應[14～16]，也會導致家蠶出現早熟現象，使家蠶繭質變劣且死亡率較高[17]，而家蠶追寄蠅寄生的引起家蠶早熟的機制尚不清楚。我們前期研究發現一種非專化性雙翅目寄蠅—日本追寄蠅（Exorista japonica）的寄生可引起家蠶上蔟提前，但出現化蛹障礙，這一現象產生的原因主要是寄生導致寄主激素和糖代謝異常所致[18]。家蠶的變態發育主要受由蛻皮激素20-羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）啟動[19]。20E 及其前體蛻皮酮（ecdysone）主要是以食物中的膽固醇或植物固醇類物質為原料在昆蟲前胸腺及外周組織合成，經由“Halloween”基因（Sro、Spo、Phm、Dib、Sad、Shade）編碼的蛋白酶的催化。20E 通過與其受體EcR/USP 形成復合體，啟動下游轉錄因子如E75、Hr3和Ftz-f1等的表達。其中Ftzf1的精準表達時間是保證昆蟲正常蛻皮和變態所必須的。20E 對Ftz-f1 存在負調控作用，Ftz-f1 是在20E消失后進行表達[20]。本試驗統計了追寄蠅寄生家蠶的齡期經過，并初步探索了寄生對家蠶20E 合成和信號通路調控機制，通過本研究可以更好地了解追寄蠅對寄主生長發育的調控，為后續深入研究其調控機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試家蠶和追寄蠅品種

供試家蠶品種為“菁松×皓月”，由東臺市天潤蠶種有限公司提供，飼養溫度25 ℃±1 ℃、相對濕度75%±5%，12 h 黑暗12 h 光照交替。供試追寄蠅品種為家蠶追寄蠅，由江蘇如皋市蠶桑技術指導站提供，置于養蟲籠（45 cm×30 cm×30 cm）中飼養，飼養溫度25 ℃±1 ℃、相對濕度85%。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗材料收集

取5齡1 d的家蠶置于飼有羽化3 d的追寄蠅培養箱中，供追寄蠅產卵，家蠶與追寄蠅的數量比為1∶30。3 h 后取出，在放大鏡下觀察家蠶體壁，選取出體表僅有1粒卵的家蠶繼續飼養。同時取未被追寄蠅寄生的家蠶作為對照組。對照組和寄生組均設置3組重復，每次重復各20頭蠶。記錄家蠶從5齡起蠶（day 1 of 5th instar，L5D1）發育至預蛹期第2 d（day 2 of prepupa stage，PP2）的時間。同時解剖并收集寄生后1 d～6 d（家蠶處于5 齡3 d-吐絲期第1 d）（L5D3-day 1 of spinning stage，L5D3-SP1）及對照組家蠶的血清、脂肪體和前胸腺，每個時間點取3個組織樣品重復，每個組織樣品來源于5 頭家蠶組織的混合。

1.2.2 RNA提取及cDNA的合成

采用液氮研磨家蠶前胸腺和脂肪體，利用TRIzol（Takara）法提取RNA，加入DNase去除基因組DNA 的污染。利用超微量分光光度計NanoDrop 2000 檢測RNA 的濃度和純度。取1 μg 的總RNA，采用M-MLV RTase試劑盒反轉錄合成cDNA的第1條鏈（Takara）。

1.2.3 目的基因的轉錄水平檢測

以cDNA 為模板，Rp49 為內參基因測定20E 合成 基 因（BmSro，BmSpo，BmPhm，BmDib，BmSad，BmShd）和下游基因（BmUSP，BmEcRA，BmE75，BmBrc，BmHr3，BmE93）mRNA 的表達。采用SYBR Premix Ex Taq?（Takara）試劑盒在ABI Viia 7 Realtime PCR儀上進行。反應體系為20 μL：cDNA模板1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，50×ROX Ref?erence Dye 0.4 μL，10 mM 上下游引物各0.5 μL，ddH2O 7.8 μL。反應條件為：95 ℃變性1 min；95 ℃5 s，55 ℃10 s，72 ℃10 s，共45 個循環；72 ℃終延伸10 min。采用2?ΔCT的方法分析基因的轉錄水平。每個基因的轉錄水平為3 個生物學重復的平均值。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR Primer Sequence

1.2.4 20E 滴度的檢測

根據20E 酶聯免疫檢測試劑盒（三價公司）說明，利用試劑盒提供的標準品制作標準曲線，取10 μL血清溶解于試劑盒中的ELISA buffer，樣品最終稀釋度為5 倍。將樣品加于酶標板底部并混勻，37 ℃反應30 min，洗板后加入酶標試劑，37 ℃反應30 min，洗板后加入顯色液顯色10 min，加入終止液，15 min內讀取OD值并根據標準曲線計算20E滴度。

1.3 統計分析

利用K-S 檢驗分析實驗數據分布的一致性，利用T檢驗對兩組數據進行顯著性分析。實驗數據用平均數±標準差（Mean±SD）表示，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。利用SPSS 19.0（SPSS，Chicago，IL，USA）對實驗數據進行分析。利用GraphPad Prism 7繪圖軟件對實驗數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 家蠶追寄蠅寄生對5齡家蠶齡期的影響

追寄蠅在家蠶體表產卵的2.5 d～3 d后，卵下方或者周邊出現寄生黑點，表明孵化的幼蟲成功侵入家蠶體內（圖1A）。幼蟲在蠶體內發育至3齡，成熟的3齡幼蟲在家蠶預蛹后期鉆出。未寄生的對照組家蠶從5 齡起蠶（L5D1）發育至預蛹期第2 d（PP1）歷經10.8 d，寄生組為10.1 d（圖1B）。

圖1 追寄蠅寄生家蠶的齡期統計Fig. 1 The Effect of E. sorbillans Parasitization on the Development of the Host B. mori.

2.2 家蠶追寄蠅寄生對5齡家蠶血清中20E滴度的影響

利用酶聯免疫分析檢測追寄蠅寄生后1 d、3 d和5 d 的家蠶和未寄生的對照家蠶血清中的20E 滴度。結果顯示：在對照組和寄生組家蠶血清中，20E的滴度均隨著家蠶齡期的增長而增加。在寄生后第1 d，對照組和寄生組家蠶體內20E滴度無顯著差異。在寄生后第3 d 和第5 d，寄生組家蠶體內的20E 滴度均顯著高于對照組，分別是對照組的1.23和1.50倍（圖2）。

圖2 追寄蠅寄生家蠶體內20E滴度的檢測Fig. 2 Detection of 20E Titers in B. mori Parasitized by E. sorbillans

2.3 追寄蠅寄生對5齡家蠶前胸腺中20E合成酶基因轉錄水平的影響

利用實時熒光定量PCR檢測追寄蠅寄生家蠶的前胸腺中20E 合成酶基因（BmSro，BmSpo，BmPhm，BmDib，BmSad，BmShd）的表達變化。結果如圖3 所示，在寄生1 d時，寄生組家蠶BmSro，BmSpo，BmPhm，BmDib和BmSad的轉錄水平顯著低于對照組，而BmShd的相對表達量顯著高于對照組（圖3A）。家蠶BmSro，BmPhm，BmSad和BmShd的轉錄水平在寄生后第3 d 顯著高于對照組，分別是對照組的1.41，1.23，2.91 和1.24 倍，而BmSpo和BmDib的轉錄與對照組相比無顯著變化（圖3B）。在追寄蠅寄生后的第5 d，BmSro，BmSpo，BmPhm和BmSad的轉錄水平顯著高于對照組，BmDib和BmShd的轉錄無顯著變化（圖3C）。因此，追寄蠅可調控家蠶前胸腺20E合成酶基因的表達，進而調控家蠶體內20E的合成。

圖3 追寄蠅寄生對家蠶20E合成酶基因轉錄調控的分析Fig. 3 Analysis of the Transcriptional Regulation of 20E Biosynthetic Genes in B. mori Parasitized by E.sorbillans.

2.4 追寄蠅寄生對5齡家蠶脂肪體中20E下游基因轉錄的影響

接下來，我們利用實時熒光定量PCR 檢測追寄蠅寄生對家蠶20E 信號通路上的重要響應基因（BmUSP，BmEcR- A，BmFtz- f1，BmE75，BmBrC，BmHr3，BmE93）表達水平的影響。結果如圖4所示，在寄生1 d 和3 d，BmE75，BmHr3，BmBrC，BmE93和BmFtz-f1持續上調表達，是對照組的1.38～9.36 倍（圖4 A，B）。在寄生后第5 d，BmEcR-A和BmE93的轉錄水平顯著高于對照組；而BmHr3，BmBrC和BmFtz-f1的表達受到抑制，轉錄水平分別是對照組的0.08，0.10 和0.24 倍（圖4C）。這些結果表明，追寄蠅寄生調控寄主家蠶20E下游應答基因的轉錄。

圖4 追寄蠅寄生對家蠶20E信號通路基因轉錄調控的分析Fig. 4 Analysis of the Transcriptional Regulation of 20E Signaling Pathway Genes in B. mori by the Parasitism of E. sorbillans.

3 討論

近年來，國內外對追寄蠅的寄生行為、寄生規律和危害狀況調查有一定成果，但對其具體寄生機制的深入研究尚且缺乏。已有研究報道，追寄蠅寄生3齡～5 齡初期家蠶造成的寄主死亡率接近100%[13]，但追寄蠅對家蠶影響的調查尚不全面。本研究中，5齡1 d的家蠶被追寄蠅寄生后，出現提前進入預蛹期的現象，同時，成熟的追寄蠅3齡幼蟲均在家蠶預蛹期鉆出化蛹。已有研究發現多種寄生蜂和寄蠅調控寄主發育的方式主要有兩種，一種為加快寄主發育，導致寄主早熟，另一種則導致寄主發育受阻，使寄主滯留在特定時期[18，21，22]，表明寄生性昆蟲通過調節寄主發育創造更適合其自身的寄主環境的現象具有普遍性。

完全變態昆蟲的發育主要由蛻皮激素20E和保幼激素（juvenile hormone，JH）相互拮抗、協調控制，其滴度的改變能夠誘導昆蟲進入特定的發育階段，如蛻皮和化蛹[19，23]。前期研究發現，日本追寄蠅可通過誘導家蠶體內20E 滴度的上升和JH 滴度的下降進而加快寄主發育[18]，而本試驗同樣發現家蠶追寄蠅寄生可以通過誘導家蠶體內20E合成以及影響20E 信號傳導調控家蠶的齡期經過，推測家蠶追寄蠅可能也通過調控寄主激素代謝進而加快其發育。家蠶體內20E滴度在5齡末期之前極低，在5齡末期即徘徊期開始急劇上升，在預蛹期達到峰值，而在預蛹后期迅速下降，形成20E脈沖，同時家蠶完成預蛹-蛹的轉變[24]。而這一過程的成功完成也需要JH滴度變化來共同調控，家蠶在5齡初期時處于JH 滴度高峰，而在5 齡期末期JH 滴度則快速下降，在5齡末到蛹期的階段，JH 滴度急劇下降到幾乎為0，從而使20E 不受到拮抗而誘導蛹化變態[24]。因此，家蠶追寄蠅的寄生可能不僅調控20E 的合成與信號通路，還對JH 的合成和信號傳導有調控作用，進而加快寄主幼蟲發育。

此外，在昆蟲中，Hr3 可直接上調Ftz-f1 的表達，而E75 可直接結合Hr3 抑制Ftz-f1 表達，因此Hr3 可通過正負反饋調控Ftz-f1 表達控制昆蟲的發育變態[25]。本研究中發現，追寄蠅寄生后第5 d，20E 滴度持續上升，導致Hr3 和Ftz-f1 的轉錄均被下調。20E 的過量合成可加快寄主的發育，但同時會導致下游信號轉導異常，使家蠶無法完成正常的發育。