HPLC法測定桑葉1-脫氧野尻霉素（DNJ）含量的方法學研究＊

鐘 石，吳偉杰，霍進喜，陳慧芝，孫雨晴，牛 犇，馬煥艷，潘美良，李有貴＊

（1. 浙江省農業科學院，浙江 杭州 310021； 2. 浙江省農業技術推廣中心，浙江 杭州 310020）

浙江是我國傳統的栽桑養蠶地區，擁有桑園面積達80000 hm2。隨著經濟發展，蠶農養蠶效益明顯下滑，浙江養蠶面積逐年銳減，大量桑園廢棄，造成資源浪費。而桑葉是一種藥食兩用的植物資源[1]，含有多種活性物質[2]，如生物堿、黃酮、多糖、甾醇等，具有降血糖[3]、降血脂[4]、抗氧化[5]和抗腫瘤[6]等多種功效。其中桑葉降血糖早在《本草綱目》等古代醫書中就有記載“能止消渴”，而現代研究表明桑葉中的1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是其起到降血糖作用的主要活性成分之一，它是一種天然α-糖苷酶抑制劑[7，8]，是唯一國際公認的零傷害生物制劑[9]，具有降糖脂[10～14]、抗腫瘤[15]、抗病毒[16]、抗炎[17]等多種藥理活性，受到全世界的廣泛關注。

本研究在參考已有方法的基礎之上[8]，采用單因素考察試驗，逐一優化了桑葉DNJ 的提取測定方法，并考察該提取測定方法的精密度、重復性、回收率、中間精密度等參數，最后利用該方法測定不同品種桑葉中DNJ 的含量，從而可為桑葉DNJ 含量測定提供方法依據，為后續從不同品種桑葉中篩選高含量的桑葉材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試桑葉品種

桑葉DNJ提取方法優化研究中所用桑樹品種為“農桑14號”，供測試的24個品種（表1）桑葉樣品于2022年5月采摘自浙江省農科院桑園試驗區，40 ℃烘干粉碎后備用。

表1 供試桑品種Table 1 List of mulberry leaves species

1.1.2 儀器與耗材

WATERS600 液相色譜儀，SunFireTMC18 色譜柱，2414 檢測器，烘箱，ML-204 分析天平（MET?TLER-TOLEDO，上海），HH-6 恒溫水浴鍋（晶玻實驗儀器公司），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），DNJ標準品（sigma），FMOC-CL（sig?ma），乙腈（Tedia），硼酸鉀，甘氨酸，醋酸，乙醇，甲醇等均為AR。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制備

精密稱取25 mg DNJ標準品，加適量純水溶解，定容于25 mL 容量瓶中，配成1 mg/mL 的DNJ 標準液。

精密吸取12.5、25、50、100、200 μL 的DNJ 標準液入試管中，分別用0.05 mol/L HCl液補足至1 mL，混勻，得到12.5、25、50、100、200 μg/mL 的DNJ 標準品溶液。

取10 μL試液，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在30 ℃的水浴鍋中反應30 min。加10 μL 0.1 mol/L甘氨酸液終止反應。反應液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋后進行高效液相色譜（HPLC）分析。

HPLC 分析條件為：分離柱SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相0.05%醋酸與乙腈的體積比為65∶35，柱溫為室溫，流速1 mL/min，進樣量10 μL，采用2414檢測器采集熒光信號，測定峰面積。

1.2.2 桑葉DNJ提取方法優化

1.2.2.1 粉碎粒度考察

取本品分別過50 目篩、65 目篩的粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加入50 mL 0. 05 mol/L HCl溶液為提取劑，超聲波（40 KHz）提取60 min，10000 rpm 離心10 min，保留上清液，其余操作同標準曲線測定步驟，重復三次。

1.2.2.2 提取液考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，加入50 mL 純水、50%乙醇、50%甲醇溶液為提取劑，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液，其余操作同標準曲線測定步驟。

1.2.2.3 提取液pH值

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，加入50 mL pH=1.0、pH=2.0、pH=4.0、pH=6.0、pH=8.0、pH=10.0 緩沖液為提取液，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液，其余操作同標準曲線測定步驟。

1.2.2.4 提取液體積

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，加入25、50、100、150、200 mL提取溶液為提取劑，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液，其余操作同標準曲線測定步驟。

1.2.2.5 超聲提取時間考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL 離心管中，加入0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超聲波提取20、40、60、80、100 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液，其余操作同標準曲線測定步驟。

1.2.2.6 衍生化溫度

精密量取供試品溶液10 μL，置1.5 mL 離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在25、30、40、50、60 ℃的條件下反應30 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應，其余操作同標準曲線測定步驟。

1.2.2.7 衍生化時間

精密量取供試品溶液10 μL，置1.5 mL 離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL 試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應0、10、20、30、40、50、60 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應，其余操作同標準曲線測定步驟。

1.2.2.8 精密度考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，加入200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液。

精密量取同一供試品溶液10 μL 6份，置1.5 mL離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應10 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應。反應液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋后進高效液相，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品溶液中DNJ的含量，計算，即得。

含量RSD不大于3%，說明精密度良好。

1.2.2.9 重復性考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，加入200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液，超聲波提取60 min，10000 rpm離心10 min，保留上清液。各平行操作6份。

精密量取同一供試品溶液10 μL置1.5 mL離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL 試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應10 min。加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應。反應液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋后進高效液相，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品溶液中DNJ的含量，計算，即得。

含量RSD不大于3%，說明重復性良好。

1.2.2.10 回收率考察

取本品粉末約0.2 g，精密稱定，加入一定量的DNJ（相當0.1 g樣品含量的80%、100%、120%，各平行操作3份），用200 mL 0.05 mol/L HCl 溶液的提取液超聲波提取60 min，10000 rpm 離心10 min，保留上清液。

精密量取供試品溶液10 μL，置1.5 mL 離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL 試管中混合。加入20 μL 5 mmol/L FMOCCL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應10 min。加10 μL 0.1 mol/L甘氨酸液終止反應。反應液用950 μL 0.1%（V/V）醋酸液稀釋后進高效液相，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品溶液中DNJ的含量，計算，即得。

各回收率在92%～105%之間，RSD 不大于3%，說明準確度良好。

1.2.2.11 中間精密度試驗

由不同實驗人員于不同時間取本品粉末約0.2 g，按重復性考察試驗，平行操作6 份，于不同儀器上測定，12份樣品含量RSD不大于3%，說明中間精密度良好。

1.2.3 數據處理

采用Excel 2013對實驗數據進行處理。

2 結果

2.1 粉碎粒度對DNJ含量測定的影響

從圖1 中可以看出，經過50 目篩、65 目篩后的樣品，測得的桑葉DNJ含量分別為0.17%、0.08%，因此選擇桑葉DNJ含量較高的50目篩作為粉碎粒度。

圖1 粉碎粒度對桑葉DNJ含量測定的影響Fig. 1 Effect of Grinding Size on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.2 提取溶劑考察

從圖2 中可以看出，不同的提取溶劑對桑葉DNJ含量影響較大，利用H2O、50%甲醇、50%乙醇作為提取溶劑，桑葉DNJ 含量分別為0.15%、0.04%、0.08%，因此選擇DNJ 含量較高的超純水作為提取液溶劑。

圖2 提取溶劑對桑葉DNJ含量測定的影響Fig. 2 Effect of Extraction Solvent on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.3 提取液pH考察

不同提取液pH 對桑葉DNJ 含量影響如圖3 所示。從結果中可以明顯看出當提取液pH=2 時，桑葉DNJ 含量較高。因此選擇DNJ 含量較高的pH=2緩沖液作為提取液。

圖3 pH對桑葉DNJ含量測定的影響Fig. 3 Effect of pH on DNJ Content in Mulberry leaves

2.4 提取液體積考察

從圖4 中可以看出隨著提取液體積的增加，桑葉DNJ 含量隨之升高，但是提取液體積增加到一定程度后，DNJ含量趨于平穩。因此，最終選擇的提取液體積為200 mL。

圖4 提取液體積對桑葉DNJ含量測定的影響Fig. 4 Effect of Extraction Volume on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.5 提取時間考察

從圖5中可以明顯看出隨著提取時間的延長對桑葉DNJ 含量影響不顯著，超聲20 min～100 min，DNJ 含量分別為0.21%、0.21%、0.22%、0.22%、0.23%。考慮到提取效率，選擇用時短的為超聲時間，即超聲時間為20 min。

圖5 提取時間對桑葉DNJ含量測定的影響Fig. 5 Effect of Extraction Time on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.6 衍生化溫度考察

DNJ 是一種對溫度比較敏感的化學物質，當溫度達到一定程度后，DNJ 會發生降解。從圖6 可以看出隨著衍生化溫度的升高，桑葉DNJ 含量隨之下降，從0.20%降至0.08%。因此，在DNJ衍生時，選擇在25 ℃下進行。

圖6 衍生化溫度對桑葉DNJ含量的影響Fig. 6 Effect of Derivative Temperature on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.7 衍生化時間考察

從圖7 中可以看出，當衍生化時間在10 min～60 min 之間，桑葉DNJ 含量沒有明顯變化。因此選擇衍生化10 min作為反應條件。

圖7 衍生化時間對桑葉DNJ含量測定的影響Fig. 7 Effect of Derivative Teme on DNJ Content in Mulberry Leaves

2.8 精密度考察

對同一樣品進行6 次測定，桑葉DNJ 的含量分別為0.26%、0.27%、0.27%、0.26%、0.27%、0.27%，RSD=1.81（n=6），結果表明該測定方法精密度良好。

2.9 重復性考察

測定6 個桑葉樣本中DNJ 含量，結果分別為0.25%、0.26%、0.25%、0.24%、0.25%、0.25%，RSD=2.20（n=6），結果表明該測定方法重復性良好。

2.10 回收率考察

表1 顯示，本方法的加標回收率在95.89%～103.65%之間，RSD 為2.76%，表明本方法的準確度良好。

表1 DNJ加樣回收率（n=9）Table 1 Recovery Rate of DNJ (n=9)

2.11 中間精密度試驗

兩個實驗人員的12 份樣品含量RSD 為2.83%，結果表明中間精密度良好（表2）。

表2 中間精密度試驗結果Table 2 Results of Intermediate Precision Test

2.12 不同品種桑葉DNJ含量測定

在確定了本研究優化的方法具有良好的精密度、重復性、回收率等之后，本研究測定了桑樹資源圃中24 種桑葉DNJ 含量（采摘時間2022 年5 月27日）。結果（見表3）顯示，24份樣品DNJ含量在0.08%～0.57%之間，不同品種桑葉DNJ含量差異較大。

表3 不同桑葉品種DNJ含量的測定Table 3 DNJ Content in Mulberry Leaves of Different Species

3 結論

本文開展了桑葉DNJ 含量測定的方法學研究。依次考察了桑葉樣品的粉碎粒度、提取溶劑、提取時間、衍生化溫度、衍生化時間等提取條件對DNJ 含量的影響，最后確定桑葉樣品的最優提取測定方法為：桑葉粉碎過50目篩，0.2 g樣品加200 mL pH=2.0 緩沖液，超聲提取20 min，10000 rpm 離心10 min，保留上清液；精密吸取樣品溶液10 μL，置1.5 mL 離心管中，與10 μL 0.2 mol/L（pH=7）硼酸鉀緩沖液在1.5 mL 試管中混合，加入20 μL 5 mmol/L FMOC-CL（溶解于乙腈中），迅速混勻并在室溫條件下反應10 min，加10 μL 0.1 mol/L 甘氨酸液終止反應。同時，對該方法進行了系統的方法學驗證，完成了精密度、重復性、準確度和中間精密度等試驗。驗證試驗結果表明：該方法專屬性好，方法的準確度高、重復性好。測定20多個品種桑葉中DNJ含量，結果發現品種差異較大，可為后續桑葉DNJ的開發利用提供參考依據。