液相色譜-串聯質譜法用于鮮桑葉中31種農藥殘留分析＊

張國平，湯逸飛，孫海燕，黃 芳，屠雨晨，陳文海，戴建忠，陳欣慰

（1. 嘉興市農業綜合檢驗檢測中心，浙江 嘉興 314050； 2. 海寧市經濟作物技術服務站，浙江 海寧 314400）

桑樹在我國較為常見，桑園成片綜合開發，其葉片可養蠶繅絲和食藥兩用[1]，因此桑園中的桑樹盡量不用一般殺蟲劑農藥，而多使用安全間隔期短[2]的備案農藥如甲基硫菌靈等殺菌劑農藥，因此其他農藥在桑葉中如有檢出殘留則多為農藥污染。鮮桑葉是指桑樹長出的新鮮葉片，此時的桑葉含水量較多，農藥殘留檢測中有利于消除基質干擾；更重要的是，春季的鮮桑葉采摘時其他農作物農藥使用還未達到高峰，空氣和灌溉用水中污染還未完全擴散，桑葉養蠶中毒事件較少。以春季鮮桑葉為基質，對鮮桑葉中31種農藥污染進行方法學的驗證并通過校準曲線進行定量分析，技術上可提供對特定的農藥污染的檢出，進而可能導致蠶中毒進行提前預警，對蠶桑生產具有一定的現實意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

鮮桑葉采集設定在2021年4月～5月，選取嘉興地區前期已飼養過家蠶而未發生家蠶中毒事件的蠶?；?家共2批次樣品，隨機摘取葉片，每份樣品不少于1 kg，每次采樣后將樣品切碎后進行勻漿并貯存于低溫冰箱中以待處理。

1.2 試劑和儀器

樣品前處理中，提取試劑為4.0 g 硫酸鎂、1.0 g氯化鎂、1.0 g 檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉；凈化試劑為150 mg 乙二胺-N-丙基硅烷、15 mg 石墨化炭黑和885 mg 硫酸鎂。其他材料包括：超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）、乙腈（色譜級，美國TEDIA 公司）、甲酸（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、1 mol·L-1乙酸銨溶液（上海麥克林生化科技有限公司）和有證標準物質（北京曼哈格生物科技有限公司）。

樣品檢測流程中，超高效液相色譜/四級三重桿串聯質譜儀（LC-20AD/QTRAP4500，日本島津公司/美國AB Sciex公司）為分析儀器；垂直振蕩器（HVS-10M，天津恒奧科技發展有限公司）、多管旋渦混合儀（BTV-100，上海一恒科技有限公司）、離心機（ROTINA 420R，德國Hettich 公司）、電子天平（Scout SE-SE202F，美國OHAUS 公司）和旋渦混合器（XW-80A，上海精密科學儀器有限公司）為其他重要儀器。

1.3 檢測流程和方法

檢測流程中樣品前處理步驟：量取樣品10.0 g，加入10 mL 乙腈溶液，加入提取鹽試劑包和1 枚陶瓷均質子，振搖1 min，4200 r·min-1離心5 min；分別取上清提取液和乙腈各3.0 mL 轉移到凈化離心管中，渦旋1 min，4200 r·min-1離心5 min；取上清凈化液，0.22 μm水膜過濾待測液，等待分析儀器進樣。

檢測方法中，液相色譜柱采用Kinetex Biphenyl柱（2.6 μm，2.1 mm×100 mm），流動相A 為（0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液），B 為乙腈，流速0.5 mL·min-1，柱溫35℃，進待測液1 μL。檢測過程流動相初始條件為A∶B=95∶5，保持4 min；A∶B=95∶5→80∶20，運行0.5 min；A∶B=80∶20，保持3.5 min；A∶B=80∶20→60∶40，運行0.5 min；A∶B=60∶40，保持2.5 min；A∶B=60∶40→36∶64，運行0.5 min；A∶B=36∶64，保持3.5 min；A∶B=36∶64→5∶95，運行1 min；A∶B=5∶95，保持4 min；A∶B=5∶95→95∶5，運行0.1 min；A∶B=95∶5，保持15 min。MRM模式下，正離子電噴霧離子源（ESI+）設定源參數為噴霧電壓（IonSpray Voltage）、輔助氣1（GS1）、輔助氣2（GS2）、輔助氣加熱溫度（TEM）和氣簾氣（CUR）均為默認設置[3]。檢測儀器獲得的數據通過工作站MultiQuant進行圖像處理和數據分析。

2 結果與分析

2.1 鮮桑葉基質對數據分析的影響

鮮桑葉基質在檢測中可能存在假陽性，因此本研究對鮮桑葉基質進行檢測。提取離子流圖（XIC）結果表明，鮮桑葉基質采用QuEChERS 試劑包不會產生假陽性。鮮桑葉加標基質的峰形良好，沒有雜峰干擾并且響應較大的離子對為定量離子對。鮮桑葉基質中31 種農藥的總離子流（TIC）如圖1 所示。

圖1 鮮桑葉基質中31種農藥（100 μg/L）的總離子流圖Fig. 1 Total Ion Graph of 31 Pesticides (100 μg/L) in Fresh Mulberry Leaves

2.2 農藥質量參數驗證

分別精密吸取各農藥標準品儲備液，用鮮桑葉基質甲醇溶液配制成10 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、150 μg·L-1和250 μg·L-1系列濃度，按照保留時間順序分段檢測，采用定量離子對的峰面積繪制標準曲線。

結果表明，31種農藥在10 μg·L-1～250 μg·L-1的范圍內線性關系良好（表1），其線性回歸曲線的相關系數r在0.9901～0.9981之間。

表1 31種農藥在鮮桑葉基質中的線性回歸方程和相關系數Table 1 Linear Regression Equations and Correlation Coefficients of 31 Pesticides in Fresh Mulberry Leaves

2.3 回收率和精密度試驗結果

3種加標樣品為向空白鮮桑葉樣品中分別添加低濃度（0.01 mg·kg-1）、中濃度（0.10 mg·kg-1）和高濃度（0.25 mg·kg-1）3種農藥混合標準溶液。經過提取和凈化步驟處理后，液相色譜三重四級桿串聯質譜上樣，每個樣品連續測試3針，每個樣品設置3個平行，根據XIC 以獲得每種農藥的峰面積用來計算回收率（P）和精密度（RSD），見圖2。

圖2 31種農藥在鮮桑葉基質中回收率和精密度的平均值（n=3）Fig. 2 Average Recoveries and Precision Rates of 31 Pesticides in Fresh Mulberry Leaves (n=3)

結果低濃度（0.01 mg·kg-1）p 范圍為69.14%～127.81%，RSD 為0.92%～29.75%；中濃度（0.1 mg·kg-1）p 范圍為75.59%～126.28%，RSD 為0.44%～20.57%；高濃度（0.25 mg·kg-1）p 范圍為70.43%～108.61%，RSD 為0.38%～16.51%。該檢測方法準確度和精密度相對滿足要求。

3 討論和小結

雖然桑葉藥材產品中農藥多殘留檢測分析有一定數量的報道[4，5]，但鮮桑葉含水量相對更多，因此兩者檢測方法特別是前處理方法并不能混用。目前，鮮桑葉的農藥多殘留檢測研究報道多以定性為主的農藥殘留快速檢測手段[6，7]，檢測項目有限。因此，本研究嘗試將鮮桑葉樣品經乙腈提取，以QuEChERS 法為前處理技術，在質譜多反應監測（MRM）模式下，進行基質外標法定量，用液相色譜三重四級桿串聯質譜法同時測定鮮桑葉中31 種農藥殘留，檢測結果顯示：在10 μg·L-1～250 μg·L-1范圍內線性關系良好，采用標準曲線法對加標量分別為0.01 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1和0.25 mg·kg-1的空白基質樣品進行加標回收試驗，加標回收率相對滿足準確度和精密度要求。該方法可及時篩查桑葉中農藥多殘留情況，為家蠶飼養用桑葉安全生產提供技術支持。

實地走訪兩家成片桑園也發現，首先，桑園遠離其他農作物種植基地，其他種類農藥污染累積的來源較少；其次，桑園外圍的桑樹既可用于景觀，又可對所在及周邊的土壤、灌溉水和空氣中農藥污染風險因子進行必要的物理阻隔，桑園深處的桑葉用于蠶桑或果桑生產[8]；第三，桑園土壤和水環境中微生物對于稀釋農藥污染也具有一定的自凈能力[9]。用于蠶桑生產的兩批次樣品中沒有檢測出31 種農藥殘留，抽樣分析證明桑園農藥污染風險較低[10]。

最后，鑒于成片桑園春季的鮮桑葉農藥污染較少，因此可以將桑園前期已飼養過蠶而未發生蠶中毒事件的桑葉作為桑葉的基質標準提前進行制備冷凍保存，檢測時可作為基質標準，減少定量檢測中基質干擾，增加定量準確度，從而達到快速定量篩查的目的。