結直腸癌組織中血漿激肽釋放酶B1 蛋白的表達變化及其臨床意義

周凡，齊月雯，時軍利，王磊，何培元，陳健，王渝，李炳慶

承德醫學院附屬醫院消化內科，河北承德067000

結直腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一，據2020年美國癌癥學會發布的全球癌癥統計數據顯示，其發病率居惡性腫瘤第3 位，死亡率高居第2 位，已嚴重威脅人類的健康［1］。盡管目前可以通過手術及放化療等方式得以改善，但由于其早期癥狀隱匿，且臨床尚無診斷和預后的特異性指標，多數患者發現時已屬于中晚期，錯失了最佳治療機會［2-4］。因此，尋找特異性診斷、預測和靶向治療標志物成為結直腸癌研究的關鍵問題。血漿激肽釋放酶B1（Plasma Kallikrein B1，KLKB1）是一種絲氨酸蛋白酶，廣泛存在于多種組織和血液中，參與內源性凝血級聯反應、炎癥反應、纖溶系統、腎素—血管緊張素系統等多種生理病理過程［5-7］。近年研究［8-9］證實，KLKB1在肺和胸膜腫瘤、肝癌組織中表達降低，具有抑制腫瘤的生長和增殖的作用。目前關于KLKB1 在結直腸癌的相關基因表達譜研究顯示與癌旁配對組織相比，KLKB1 基因在結直腸癌中呈現特異性低表達［10-12］，可發揮抑制結直腸癌作用。 目前國內外關于KLKB1 在結直腸癌方面鮮有報道，尚無涉及組織水平相關驗證。本研究應用免疫組織化學染色法觀察了結直腸癌及其配對癌旁組織中KLKB1 蛋白的表達變化，并分析其表達與臨床病理參數的相關性，為結直腸癌的病情評估及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1. 1 臨床資料 選取2019 年10 月—2020 年10 月在承德醫學院附屬醫院胃腸外科住院的結直腸癌患者86 例，男53 例、女33 例，年齡40～84（63. 57 ±10. 34）歲，其中年齡＜60 歲者34 例、≥60 歲者52 例，腫瘤直徑≥5 cm 者19 例、＜5 cm 者67 例，結腸癌40例、直腸癌46例，無淋巴結轉移者42例、有淋巴結轉移者44例，浸潤深度T1～T3者36例、T4者50例，臨床分期為Ⅰ+ Ⅱ期42 例、Ⅲ+ Ⅳ期44 例。所有患者均接受根治性手術治療，術中留取結直腸癌組織及癌旁正常組織（距癌組織3 cm），留取的組織標本經固定、脫水、透明、浸蠟和包埋，制作成蠟塊常溫保存。納入標準：①術后病理結果明確診斷為結直腸癌；②腫瘤患者均為初發，未接受放療和化療等相關治療；③接受根治性手術治療；④臨床病理資料完整。排除標準：①具有遺傳性腸道疾病家族史；②合并其他部位腫瘤；③嚴重心、肝、腎等臟器疾病。本研究經承德醫學院附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬簽屬知情同意書。

1. 2 結直腸癌組織及癌旁正常組織中KLKB1 蛋白檢測方法 采用免疫組織化學法。取結直腸癌組織及癌旁正常組織標本，切片后經過二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，PBS沖洗后置入檸檬酸鈉緩沖溶液中，微波加熱抗原修復。取出后冷卻至室溫，滴加3% 過氧化氫消除內源性過氧化物酶活性，正常山羊血清封閉液封閉，滴加KLKB1 一抗后4 ℃孵育過夜。次日，加入SP試劑、DAB顯色液，顯微鏡下觀察染色程度，流水沖洗終止反應，隨后蘇木精復染、鹽酸酒精分化、氨水返藍，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，采用半定量積分法在顯微鏡下觀察KLKB1蛋白表達情況。具體方法如下：①陽性細胞百分比：＜5% 記0 分，5%～25% 記1 分，26%～50% 記2分，51%～75% 記3 分，76%～100% 記4 分；②染色強度：無色記0 分，淡黃色記1 分，黃色記2 分，棕黃色記3 分，①、②兩項評分的乘積為最終評分，0～1分陰性表達，1分及以上為陽性表達［13］。

1. 3 統計學方法 采用SPSS26. 0 統計軟件。計數資料比較用χ2檢驗，相關性分析用Spearman 秩相關分析法。P＜0. 05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 結直腸癌組織及癌旁正常組織中KLKB1 蛋白陽性表達率比較 結直腸癌組織及癌旁正常組織中KLKB1蛋白陽性表達率分別為45. 3%、72. 1%，兩者相比，P＜0. 05。

2. 2 KLKB1 蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理參數的關系 KLKB1 蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理參數的關系見表1。由表1 可知，KLKB1 蛋白陽性表達與結直腸癌患者腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期有關（P均＜0. 05），與性別、年齡和浸潤深度無關（P均＞0. 05）。

表1 KLKB1蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理參數的關系

2. 3 KLKB1 蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理參數的相關性 KLKB1 蛋白陽性表達與結直腸癌患者腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期呈負相關關系（r分別為-0. 260、-0. 231、-0. 231，P均＜0. 05）。

3 討論

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，2020年我國新發結直腸癌患者約55萬，居第2位，死亡患者約29萬，居第5位［14］，嚴重威脅人們的健康。目前臨床缺少結直腸癌早期診斷和預后的特異性指標，多數患者可能錯失最佳治療機會，結直腸癌相關腫瘤分子標記物的研究越來越被國內外專業領域學者和醫生重視［15］。

KLKB1 是一種絲氨酸蛋白酶，廣泛分布于血液和多種組織中，參與凝血系統、纖溶系統、炎癥反應等多種生理病理過程［5-6，16-17］。KLKB1 在多種腫瘤中存在表達差異，越來越多的研究發現其有望成為腫瘤診療的新靶點。WONG 等［8］研究發現，經去甲基干預的肺癌及間皮瘤細胞中KLKB1 表達明顯增加。KLKB1 可通過激活激肽B1 和B2 受體發出信號，干預新血管的形成，從而抑制肺和胸膜腫瘤的生長和增殖，提示KLKB1 可作為一種抑癌基因調節腫瘤的發生發展［18］。

本研究收集臨床患者結直腸癌組織和其配對的癌旁組織，通過免疫組織化學方法從組織水平檢測KLKB1蛋白的表達情況，結果顯示KLKB1蛋白在結直腸癌組織中的表達明顯低于配對的癌旁組織，其表達的降低提示在結直腸癌中KLKB1 蛋白可能發揮抑癌作用，這與LI等［9］研究相符。此外，CHE等［19］研究發現，肝癌患者外周血中KLKB1 蛋白表達顯著降低，且與預后存在明顯相關性。

本研究收集結直腸癌患者的臨床病理資料，分析KLKB1 與患者臨床病理參數的關系，結果發現KLKB1 蛋白在結直腸癌中的陽性表達與患者腫瘤大小、淋巴結轉移及臨床分期呈負相關。CHE 等［19］研究發現，KLKB1 的表達與腫瘤分期、腫瘤分級、肝組織炎癥和Ishak纖維化評分相關，這與本次研究結果一致。已有研究［12］發現，KNG1 作為結直腸癌組織中下調的關鍵核心基因，在補體和凝血級聯中，可直接被KLKB1調控。KNG1可作為一個潛在的預后靶點，在結直腸癌及肝癌組織中呈特異性低表達，可調控凝血過程，促進轉移的發生。以上研究均提示我們，KLKB1 可能通過調控KNG1 的表達進而抑制結直腸癌的發生發展，其低表達導致結直腸癌患者臨床分期的惡化，可作為結直腸癌患者預后不良的重要信號，有望為臨床控制結直腸癌進展和轉移提供新的靶點。

綜上所述，結直腸癌組織中KLKB1 蛋白呈低表達，且其表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期之間呈負相關，可能參與了結直腸癌的發生發展，有望成為結直腸癌的診療和預后評估提供新的理想靶點。KLKB1在結直腸癌中是否可通過調節KNG1發揮抑癌作用，其中具體的作用機制如何值得我們在后續試驗中進一步驗證。