褪黑素腹腔注射對急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷凋亡的改善作用及其機(jī)制

王琮民，閆紀(jì)琳，李海濤，牛麗輝，王敏，姜黎黎

1 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邯鄲056000；2 河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3 邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

急性腦梗死是臨床常見的腦血管疾病，又稱缺血性腦卒中，多發(fā)于中老年人，患病率以及致殘率、致死率均極高［1-2］。急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展與組織中活性氧自由基過量、神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)及血腦屏障被破壞等都有密切聯(lián)系［3］。褪黑素是由松果體分泌的一種胺類激素，存在于多種細(xì)胞、組織和器官中，作為一種抗氧化劑來調(diào)節(jié)不同病理?xiàng)l件下的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等多種分子途徑［4］，具有減輕氧自由基損傷和炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、抑制細(xì)胞凋亡等作用［5］。國內(nèi)外研究［6］表明，當(dāng)腦組織受到嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)，血清中產(chǎn)生大量的內(nèi)源性褪黑素，消除細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS，減少神經(jīng)元死亡，在嚴(yán)重創(chuàng)傷性腦損傷、缺血再灌注腦損傷中均有一定的治療作用。Notch1 是Notch 信號通路的同源受體，在細(xì)胞生長進(jìn)程中起著重要作用。研究［7］表明，Notch信號通路參與細(xì)胞生長以及神經(jīng)元的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)細(xì)胞的增殖、凋亡和分化中發(fā)揮重要的作用。發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1（hairy enhancer of split 1，Hes1）是一種堿性螺旋—環(huán)—螺旋（BHLH）家族的轉(zhuǎn)錄因子，是Notch1 信號通路下游的一個(gè)重要的效應(yīng)因子，其通過促進(jìn)下游基因的表達(dá)，參與神經(jīng)干細(xì)胞的維持與增殖分化［8-9］。許多研究［10］發(fā)現(xiàn)，Notch1/Hes1 信號通路參與調(diào)控缺血性腦卒中引起的細(xì)胞凋亡、血腦屏障受損等，發(fā)揮修復(fù)作用。Notch1/Hes1 信號通路能夠維持神經(jīng)細(xì)胞未分化前的狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞分化方向的選擇［11］，在腦缺血再灌注損傷中調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的分化、增殖以及凋亡等［12］。褪黑素是否能夠通過調(diào)控Notch1/Hes1 信號通路來改善急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡尚不明確，2021 年7月16 日—2021 年9 月3 日，我們通過建立大鼠急性腦梗死模型，觀察了褪黑素腹腔注射對急性腦梗死大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷凋亡的改善作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1. 1 大鼠、試劑及儀器 SPF 級SD 大鼠60 只，8 周齡，體質(zhì)量為（300 ± 20）g，購買于中國科學(xué)動物研究所，動物許可證號為SYXK（京）2018-0021。所有動物均嚴(yán)格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為25 ℃，濕度為60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。褪黑素注射液購自Sigma-Aldrich 公司；尼莫地平購自濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Notch1、Hes1、β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自Abcam公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白裂解液（RIPA）購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；Western blotting DAB 法顯色試劑盒購自北京康納瑞生物科技有限公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、蘇木精—伊紅染色劑購自碧云天生物科技公司。Gel Doc2000 凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-RAD 公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；艾卡ULTRA-TURRAX 勻漿機(jī)購自艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；艾本德5427 R 臺式冷凍離心機(jī)購自Eppendorf 艾本德中國有限公司；SpectraMax iD5 酶標(biāo)儀購自美股谷分子儀器（上海）有限公司。

1. 2 大鼠分組、急性腦梗死模型制備、褪黑素給予方法 60 只SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、褪黑素低劑量組、褪黑素中劑量組、褪黑素高劑量組、陽性對照組，每組10只。除假手術(shù)組外，其他5組參照文獻(xiàn)［13］建立急性腦梗死模型：SD 大鼠術(shù)前禁食禁水12 h，腹腔注射3% 戊巴比妥鈉（35 mg/kg）進(jìn)行麻醉，頸部正中切口，并鈍性分離頸總動脈與頸外動脈，采用0號手術(shù)線分別結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，阻斷動脈血液流動；在頸總動脈分叉下方剪一缺口，將肝素預(yù)處理尼龍線栓插入頸內(nèi)動脈，有明顯阻力時(shí)停止插入，剪掉線栓尾端，并在頸內(nèi)動脈根部固定，清洗消毒后逐層縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后腹腔注射2萬單位青霉素，注意大鼠體溫和保暖，側(cè)臥位保持呼吸道通暢。假手術(shù)組大鼠僅游離頸總動脈，不進(jìn)行結(jié)扎操作。造模成功后穩(wěn)定30 min 開始給藥，褪黑素低劑量組、褪黑素中劑量組、褪黑素高劑量組分別給予褪黑素5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg，同一時(shí)間，假手術(shù)組與模型組給予相同體積的生理鹽水，陽性對照組給予尼莫地平15 mg/kg。給藥方式均為腹腔注射，每日1次，共給藥7 d。

1. 3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 給藥結(jié)束后24 h，根據(jù)Longa生物學(xué)評分法評估大鼠神經(jīng)功能缺損情況。0 分：小鼠活動完全正常、無神經(jīng)功能缺損癥狀；1 分：將小鼠提尾懸空后其出現(xiàn)左側(cè)前肢屈曲、肘關(guān)節(jié)伸直；2 分：小鼠爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈并且側(cè)推時(shí)左右推動的阻力不等；3 分：左側(cè)肢體肌力明顯減退導(dǎo)致其不能承受體重而向左側(cè)傾倒；4 分：呈筒樣滾動或無自主活動，出現(xiàn)意識障礙。

1. 4 各組大鼠血清氧化還原指標(biāo)及炎性因子測定 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)束后迅速麻醉大鼠，心臟取血，4 000 r/min 離心15 min，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中氧化還原指標(biāo)MDA、SOD 及炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β。

1. 5 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡情況觀察 取血后處死大鼠，開顱分離腦組織，每組隨機(jī)取部分腦組織采用4% 多聚甲醛進(jìn)行固定，之后進(jìn)行梯度乙醇脫水，石蠟包埋后制作4 μm 左右的切片，進(jìn)行蘇木精—伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組腦組織病理學(xué)變化。取各組大鼠腦組織切片，經(jīng)脫蠟、乙醇梯度水化后，按照TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書要求檢測大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。

1. 6 各組大鼠腦組織中Notch1/Hes1 信號通路相關(guān)蛋白Notch1、Hes1 檢測 取-80 ℃冰箱保存的大鼠腦組織，加入裂解液制備勻漿，運(yùn)用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定勻漿液中總蛋白含量，加5 倍蛋白上樣緩沖液置于沸水中10 min 使蛋白充分變性。取等量蛋白樣品上樣，SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 封閉1 h，加入Notch1、Hes1 和內(nèi)參β-actin 一抗稀釋液，4 ℃冰箱孵育12 h以上；沖

洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，常溫下孵育60 min，沖洗后加顯色液顯色，按照DAB顯色試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果，以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算Notch1、Hes1的蛋白相對表達(dá)量。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22. 0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以-x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組大鼠未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，計(jì)0 分；模型組、褪黑素低劑量組、褪黑素中劑量組、褪黑素高劑量組、陽性對照組大鼠神經(jīng)功能缺損評分分別為（3. 91 ±0. 63）、（3. 23 ± 0. 52）、（2. 67 ± 0. 45）、（1. 84 ±0. 47）、（1. 66 ± 0. 43）分，其中褪黑素高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分與陽性對照組相比，P＞0. 05，其余組間相比，P均＜0. 05。

2. 2 各組大鼠血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 各組大鼠血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比較見表1。由表1 可知，褪黑素高劑量組血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平與陽性對照組相比，P均＞0. 05；其余各組大鼠血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β水平組間相比，P均＜0. 05。

表1 各組大鼠血清MDA、SOD、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（-x±s）

2. 3 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡情況比較 各組大鼠腦組織病理學(xué)檢查結(jié)果見圖1。由圖1 可見，假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊有序、大小一致、形狀完整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，且分布均勻正常，未出現(xiàn)水腫變性；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞受損嚴(yán)重，細(xì)胞分布稀疏凌亂，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞核溶解現(xiàn)象嚴(yán)重；與模型組相比，褪黑素低劑量組、褪黑素中劑量組、褪黑素高劑量組、陽性對照組細(xì)胞病變現(xiàn)象減輕，褪黑素低劑量組與褪黑素中劑量組中少數(shù)細(xì)胞空泡化，細(xì)胞分布較整齊，細(xì)胞核溶解固縮現(xiàn)象減少，褪黑素高劑量組以及陽性對照組未見細(xì)胞核溶解固縮現(xiàn)象，細(xì)胞分布均勻整齊，與假手術(shù)組幾乎一致。假手術(shù)組、模型組、褪黑素低劑量組、褪黑素中劑量組、褪黑素高劑量組、陽性對照組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別為4. 02%± 0. 67%、48. 18%± 5. 23%、32. 26%± 3. 24%、25. 28%± 2. 63%、12. 82%± 1. 56%、12. 54%± 1. 23%，其中褪黑素高劑量組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與陽性對照組相比，P＞0. 05，其余組間相比，P均＜0. 05。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE染色，×400）

2. 4 各組大鼠腦組織中Notch1、Hes1 蛋白相對表達(dá)量比較 各組大鼠腦組織中Notch1、Hes1 蛋白相對表達(dá)量比較見表2。由表2可知，褪黑素高劑量組大鼠腦組織中Notch1、Hes1蛋白相對表達(dá)量與陽性對照組相比，P均＞0. 05；其余各組大鼠腦組織中Notch1、Hes1蛋白相對表達(dá)量組間相比，P均＜0. 05。

表2 各組大鼠腦組織中Notch1、Hes1蛋白相對表達(dá)量比較（-x±s）

3 討論

急性腦梗死是現(xiàn)在臨床醫(yī)學(xué)備受關(guān)注和亟待解決的一種腦血管疾病，其發(fā)病突然、難治愈，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡均有密切聯(lián)系。研究［14］證明，當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧自由基過量產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化生成MDA，SOD 作為機(jī)體內(nèi)中重要的抗氧化酶被大量消耗，腦缺血早期TNF-α、IL-6 等炎癥因子誘發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腦組織受損［15］。另外腦梗死會造成缺血缺氧中心區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)的刺激產(chǎn)生不可逆的損傷，迅速凋亡［16］。本研究結(jié)果顯示，急性腦梗死模型大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 以及MDA 含量均明顯升高，SOD活性明顯降低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多，與之前學(xué)者的研究結(jié)果一致。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞維持自身穩(wěn)定的重要機(jī)制，近年來研究［17］表明，急性腦梗死發(fā)生后缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是治療腦梗死的關(guān)鍵，因此利用藥物的保護(hù)作用抑制缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡對減輕急性腦梗死損傷具有重要的研究意義。

褪黑素是一種吲哚類激素，它具有高親和性，容易通過血腦屏障作用到受損神經(jīng)組織，發(fā)揮緩解炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷以及抗細(xì)胞凋亡等作用［18］。研究［19］發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以通過誘導(dǎo)抗氧化酶生成、清除組織中氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡等途徑改善神經(jīng)組織受損。也有學(xué)者研究［20］表示，褪黑素能夠通過抑制NF-κB 信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，改善大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后認(rèn)知功能障礙。本研究結(jié)果表明，褪黑素可以通過調(diào)控炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和氧化還原指標(biāo)MDA、SOD 的釋放，減輕氧化應(yīng)激，抑制炎癥反應(yīng)，達(dá)到抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及改善急性腦梗死后神經(jīng)功能的作用。

Notch1/Hes1 信號通路參與缺血再灌注損傷，修復(fù)神經(jīng)組織受損，調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)育［21］，Notch1 通路的激活導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損，引起神經(jīng)元凋亡，誘導(dǎo)腦功能障礙［22］，使用其抑制劑可以減輕神經(jīng)元凋亡，對缺血神經(jīng)元起到保護(hù)作用［23］。Hes1 是Notch1 信號的靶基因，Notch1 被激活后可與其相應(yīng)配體結(jié)合，誘導(dǎo)Hes1 轉(zhuǎn)錄，因此其表達(dá)水平是評估Notch信號表達(dá)的重要指標(biāo)［24］。也有研究［25］證明，激活Notch1/Hes1 信號通路可以促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，來改善腦卒中后大鼠的神經(jīng)功能障礙。因此，Notch1/Hes1 信號通路的激活既有利又有弊，適當(dāng)促進(jìn)Notch1/Hes1 信號通路激活可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，抑制神經(jīng)元凋亡；但Notch1/Hes1 信號通路過度激活會誘導(dǎo)炎性因子及氧自由基的釋放，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，造成神經(jīng)細(xì)胞受損，凋亡率升高。本研究通過設(shè)計(jì)急性腦梗死大鼠模型，利用褪黑素作為藥物干預(yù)，結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織中Notch1、Hes1 蛋白表達(dá)顯著升高，即Notch1/Hes1 通路被激活；而褪黑素各劑量組大鼠腦組織中Notch1、Hes1 的蛋白表達(dá)較模型組明顯下降，表明褪黑素可抑制Notch1/Hes1 通路激活。

綜上所述，急性腦梗死發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)激反應(yīng)過表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體受損，Notch1/Hes1 通路被激活，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損。褪黑素干預(yù)后的急性腦梗死大鼠體內(nèi)炎性因子以及氧化應(yīng)激指標(biāo)水平均明顯改善，Notch1/Hes1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)降低，神經(jīng)元凋亡率降低，改善神經(jīng)功能。因此高劑量（15 mg/kg）褪黑素腹腔注射可改善急性腦梗死大鼠的神經(jīng)細(xì)胞損傷凋亡情況，其機(jī)制可能與下調(diào)Notch1/Hes1 信號通路相關(guān)蛋白Notch1、Hes1 的表達(dá)有關(guān)，為急性腦梗死神經(jīng)功能障礙提供了一種新的治療手段。 但褪黑素對Notch1、Hes1 的蛋白表達(dá)的具體作用機(jī)制尚不清晰，仍需設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制。