銀杏葉提取物通過Nrf2∕HO-1信號通路減輕老年性聾大鼠耳蝸氧化應激損傷的機制

王青玲 張夢嫻 周潁東 郭向東 康浩然 王慶林

1河南中醫藥大學第一臨床醫學院（鄭州450046）；2河南中醫藥大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科（鄭州450000）；3河南醫學高等專科學校護理系（鄭州451191）

老年性聾是由機體老化引起的雙耳對稱性、進行性感音神經性耳聾，聽力損失從高頻開始，逐步向中、低頻發展［1］。我國第二次殘疾人抽樣調查發現老年性聾的人數高達949 萬，且患病率逐年攀升［2］。目前，老年性聾的治療手段主要包括人工耳蝸植入、佩戴助聽器和藥物治療等［3］，但人工耳蝸植入和佩戴助聽器成本過高，而現有的治療藥物臨床療效欠佳［4-5］，因此，從老年性聾的發病機制入手、尋求有效治療的藥物是目前臨床上亟需解決的關鍵問題之一。老年性聾的發病機制可能與氧化應激和線粒體功能障礙引起的內耳毛細胞和螺旋神經節細胞退行性變性有關［6-7］。核因子紅系相關因子2（Nrf2）是調節細胞氧化應激和線粒體穩態的重要轉錄因子，氧化應激狀態下，Nrf2 移位到細胞核內，促進下游血紅素加氧酶1（HO-1）等抗氧化因子表達，進而降低耳蝸中氧自由基（ROS）水平，從而保護內耳細胞免受氧化應激損傷［8］。銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）是從銀杏干燥的葉中提取的有效成分，含有銀杏黃酮、槲皮素、銀杏內酯、有機酸等多種抗氧化成分［9］，其可通過降低ROS 累積，提高線粒體氧化呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ的活性和氧化磷酸化水平，進而對多種內耳疾病、心腦血管疾病和神經退行性疾病發揮保護作用［10-11］，但有關GBE 治療老年性聾機制方面的研究相對較少，為此，本研究采用D-半乳糖制備老年性聾模型，應用多種實驗方法探討GBE 能否通過調節Nrf2∕HO-1 信號通路對老化耳蝸發揮保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 從河南華興動物養殖中心購買4 周、體質量150 ～250 g、聽閾正常的雄性SD 大鼠45 只，于SPF 級飼養環境中飼養，室內溫度控制在（24 ± 3）℃，自由飲食和攝水，實驗前適應性飼養7 d，實驗動物許可證號：SYXK（豫）2020-0002。

1.2 試劑 GBE（北京華潤有限公司，Z11021350）；D-半乳糖（上海麥克林有限公司，C11484411）；TSOD和MDA（江蘇寶萊有限公司，MM-0731R1、MM-0385R1）；2.5%戊二醛（北京索萊寶公司，SP0041）；Nrf2、HO-1 抗體（美國genetex 公司，GTX103322、GTX30748）；Myosin-Ⅶa 抗體（美國Protrus BioSciences 公司，25-6790）；Alexa Flour 488 抗體（美國Jackson 公司，111-545-003）；內參GAPDH 抗體（上海UBIYOBIBIO，UBI6010）。

1.3 方法

1.3.1 模型制備和給藥方法 將SD 大鼠依次編為1-45 號，按照隨機數字表分為對照組、模型組和GBE 低、中、高劑量組，每組9 只。模型組和GBE各組大鼠均在頸背部皮下注射D-半乳糖，劑量500 mg∕（kg·d），對照組在頸背部皮下注射等量生理鹽水，共8 周［12］。造模成功后，GBE 低、中、高劑量組分別腹腔注射GBE［10、20、30 mg∕（kg·d）］，對照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續8 周。

1.3.2 聽性腦干誘發電位（ABR） 10%的水合氯醛麻醉大鼠，記錄電極置于大鼠的顱頂中點，參考電極置于檢測耳耳后，揚聲器置于距受刺激側耳廓10 cm 的位置，地線接對側耳耳后。TDT RZ6∕BioSigRZ 系統收集ABR，采用click 為刺激音，聲刺激從90 dB 開始，10 dB 遞減，接近閾值時5 dB 遞減，直至能分辨出Ⅲ波的最低刺激強度確定反應閾值。

1.3.3 酶聯免疫吸附實驗 選取治療前、后各組大鼠血清在冰上解凍，離心后取上清，按照相應試劑盒中提供的制造商說明測定T-SOD 和MDA 的含量。用黃嘌呤氧化酶法測定T-SOD，用硫代巴比妥酸法測定MDA。

1.3.4 透射電子顯微鏡觀察螺旋神經節細胞超微結構 麻醉后，斷頭處死，用2.5%戊二醛（pH 7.4）在4 ℃灌注固定24 h，脫鈣液脫鈣3 周，用顯微器械取下基底膜，1%的鋨酸4 ℃固定2 h，PBS 漂洗3 次，梯度乙醇，丙酮脫水，將組織包埋在環氧樹脂中，進行超薄切片，切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙染色（20 min），染色后，水洗，烘干，使用日本透射電子顯微鏡（JEM-1400）拍照。

1.3.5 免疫熒光染色基底膜鋪片 耳蝸用4%多聚甲醛（PFA）固定過夜，脫鈣3 周，在解剖顯微鏡下將基底膜分離為頂回、中回、底回三段，10%山羊血清封閉通透，4 ℃過夜。Myosin-Ⅶa（1∶500）孵育過夜。PBS 漂洗3 次∕10 min。二抗Alexa Flour 488（1∶500）避光孵育2 h。PBS 漂洗3 次∕10 min，DAPI（1∶800）室溫孵育15 min，抗猝滅甘油封片，在熒光顯微鏡下從耳蝸頂回至底回開始逐個視野連續計數內、外毛細胞數目，并觀察毛細胞形態。

1.3.6 免疫組織化學 石蠟切片在60 ℃烘干1 h，二甲苯脫蠟，然后梯度乙醇脫水；使用檸檬酸鈉緩沖液在180 ℃下反應90 s；室溫冷卻后，用3%H2O2溶液封閉30 min；1XPBS 漂洗3 次∕5 min；10%山羊血清封閉30 min；Nrf2 與HO-1 抗體分別用抗體稀釋液按照1∶100 比例稀釋，在4 ℃下過夜；1XPBS漂洗3 次∕5 min，Bio-羊抗兔IgG 按照1∶100 比例配置工作液，4 ℃孵育1 h；鏈霉素親和素-POD 工作液4 ℃孵育1 h；滴加DAB 顯色液在顯微鏡下顯色，待組織顏色變為棕褐色，用蒸餾水洗滌終止反應；蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察蛋白表達情況并拍照。

1.3.7 蛋白印跡法 稱取20 μg 耳蝸組織、剪碎、搗碎、冰上裂解10 min；根據BCA 試劑盒測最終蛋白上樣體積。然后制備SDS-PAGE 凝膠、電泳、轉膜、1XTBST 洗膜3 次∕5 min、5%脫脂奶粉封閉1 h、洗膜；配制目的蛋白抗體：Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000），在4 ℃過夜，利用HRP 標記的二抗在室溫孵育2 h；用ECL 發光液進行顯影，Image Lab 成像系統對形成蛋白條帶的斑點進行定量，采用GAPDH 作為內參對照，對數據進行統一處理。

1.4 統計學方法 使用SPSS 25.0 軟件進行分析，所有數據均以均數±標準差表示，多組數據比較采用單因素方差分析和Dunnett 多重比較檢驗，所有數據均重復3 次以上，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ABR 閾值 治療前，其余各組與對照組相比ABR 閾值均顯著提高（P＜0.01），表明造模成功；治療后，GBE 低劑量組與模型組比較ABR 閾值差異無統計學意義（P＞0.05），中、高劑量組ABR 閾值均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 銀杏葉提取物治療前后各組大鼠ABR 閾值變化Fig.1 Changes of ABR threshold in rats before and after Ginkgo biloba extract treatment

2.2 血清中T-SOD 和MDA 的含量 治療前，與對照組比較，其余各組血清T-SOD 含量顯著降低（P＜0.01），而MDA 含量明顯升高（P＜0.01）；治療后，與模型組比較，GBE 各組T-SOD 含量逐漸提高，MDA 含量顯著下調（P＜0.05），尤以中、高劑量組較明顯（P＜0.01），見表1。

表1 治療前后各組血清中T-SOD 和MDA 含量變化Tab.1 Changes of T-SOD and MDA in serum before and after treatment ±s

表1 治療前后各組血清中T-SOD 和MDA 含量變化Tab.1 Changes of T-SOD and MDA in serum before and after treatment ±s

注：治療前，與對照組比較，**P ＜0.01；治療后，與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別對照組模型組銀杏葉提取物低劑量組銀杏葉提取物中劑量組銀杏葉提取物高劑量組T-SOD 含量（pg∕mL）治療前440.09±36.40 295.78±28.16**300.64±14.26**283.04±27.35**306.42±36.40**治療后441.03±39.36 298.89±29.36**326.84±38.12#382.37±20.36##408.65±35.14##MDA 含量（nmol∕mL）治療前5.60±0.44 11.33±0.42**10.06±0.23**11.42±0.50**10.96±0.54**治療后5.67±0.35 10.92±0.53**8.95±0.42#6.93±0.35##6.18±0.55##

2.3 螺旋神經節細胞的超微結構 對照組螺旋神經節細胞超微結構正常，線粒體外膜和嵴清晰，髓鞘板層結構緊密，板層呈同心圓排列，邊緣光滑；模型組螺旋神經節細胞出現明顯衰老現象，線粒體數量減少，密度降低，大量線粒體空泡樣變、雙層膜破裂、嵴模糊不清，螺旋神節細胞胞漿內溶酶體聚集，髓鞘板層排列疏松、紊亂，甚至出現“脫髓鞘現象”。經不同劑量GBE 治療后，螺旋神經節細胞呈現劑量依賴性改善，胞漿內空泡化的線粒體數量逐漸降低，線粒體外膜和嵴形態逐漸恢復，髓鞘板層排列規整緊密。見圖2。

圖2 各組耳蝸螺旋神經節細胞超微結構變化Fig.2 Ultrastructural changes of cochlear spiral ganglion cells in each group

2.4 基底膜內、外毛細胞的形態和數量 對照組內、外毛細胞形態清晰，呈圓形或矩形，排列整齊，未見明顯病理損傷；模型組中，頂回內、外毛細胞基本正常，中回內、外毛細胞丟失不明顯，僅出現外毛細胞形態大小不一，底回內、外毛細胞排列紊亂，形態極其不規整，內、外毛細胞均出現大量丟失，外毛細胞丟失更嚴重（P＜0.05）；與模型組相比，GBE 各組內、外毛細胞結構逐漸清晰，形態逐漸改善，底回內、外毛細胞丟失數量明顯降低，高劑量組改善較明顯（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 免疫熒光染色觀察基底膜頂、中、底回毛細胞損傷情況（×400）Fig.3 Observation of hair cells damage in Apical turn，Middle turn，Basal turn of basement membrane by immunofluorescence staining（×400）

表2 基底膜內、外毛細胞的數量Tab.2 Number of inner and outer hair cells in basement membrane ±s

表2 基底膜內、外毛細胞的數量Tab.2 Number of inner and outer hair cells in basement membrane ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別對照組模型組銀杏葉提取物低劑量組銀杏葉提取物中劑量組銀杏葉提取物高劑量組內毛細胞頂回21.20±1.36 20.93±1.76 20.96±1.21 21.15±0.89 21.18±1.60中回20.32±0.96 19.94±1.26 19.99±0.96 20.26±0.53 20.29±1.92底回22.08±1.72 12.09±0.85*13.68±1.12#14.07±1.76#19.85±1.94##外毛細胞頂回74.30±4.73 71.58±6.25 71.96±5.97 72.87±7.03 72.98±2.96中回72.18±5.39 68.84±3.85 69.92±4.86 71.62±6.02 72.05±2.85底回78.18±3.82 48.09±8.89**54.96±6.32#59.03±5.80#73.26±6.37##

2.5 螺旋神經節細胞中Nrf2和HO-1的表達 Nrf2、HO-1 蛋白在對照組螺旋神經節細胞的胞漿中呈棕褐色表達。與對照組相比，模型組螺旋神經節細胞胞漿中Nrf2、HO-1 蛋白表達顯著降低；與模型組比較，GBE 各組Nrf2、HO-1 蛋白表達明顯上調，并表現為劑量依賴性。見圖4。

圖4 各組螺旋神經節細胞中Nrf2、HO-1 蛋白表達情況（×200）Fig.4 The expression of Nrf2 and HO-1 protein in spiral ganglion cells in each group（×200）

2.6 耳蝸組織中Nrf2 和HO-1 蛋白的表達 與對照組相比，模型組Nrf2、HO-1 的表達水平均顯著降低（P＜0.01），與模型組對比，GBE 各組Nrf2、HO-1的表達水平劑量依賴性上調，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠耳蝸中組織Nrf2、HO-1 蛋白表達的情況Fig.5 Expression of Nrf2 and HO-1 protein in cochlea of rats in each group

3 討論

老年性聾是由環境、衰老、遺傳等多種因素共同作用的結果，氧化應激和線粒體功能障礙在耳蝸細胞衰老過程中發揮了重要作用［13］。隨著年齡的增長，耳蝸線粒體中內源性抗氧化系統（T-SOD和谷胱甘肽）的活性降低，導致ROS和MDA過表達，進而損害線粒體DNA、雙層膜和呼吸鏈等成分，造成毛細胞和螺旋神經節細胞的氧化損傷［14］。Nrf2可維持線粒體的正常結構和功能，調控線粒體膜電位和氧化磷酸化水平，并促進ATP 合成，進而抑制內耳細胞氧化損傷［15］。HO-1 是Nrf2 的下游產物，Nrf2 移位到細胞核，促進HO-1 轉錄，從而降低細胞內的ROS、MDA 水平，保護細胞活力［16-17］。LI 等［18］研究發現，Nrf2 和HO-1 蛋白在衰老大鼠聽皮層中的表達明顯下調，聽功能顯著減退，其原因可能是衰老阻斷了Nrf2 的表達，抑制HO-1 轉錄，進而使抗氧化防御系統減弱，線粒體氧化損傷增強，從而導致線粒體功能障礙和ROS 過表達。由此可見，減輕機體氧化應激反應對延緩老年性聾至關重要。GBE 可通過清除ROS、提高線粒體功能對耳聾、心腦血管等疾病發揮保護作用［19］。CHEN 等［20］研究表明，GBE 可激活Nrf2∕HO-1 通路，抑制線粒體氧化損傷及凋亡，從而保護心肌細胞。然而，既往GBE 防治老年性聾的研究大多集中于臨床觀察，未曾對機制進行深入探討，鑒于此，本研究通過構建老年性聾模型，來研究GBE 是否能通過Nrf2∕HO-1 信號通路減輕氧化應激對老年性聾發揮保護作用。

既往研究采用GBE 聯合巴曲酶治療老年性聾患者，治療后老年性聾患者的純音聽閾閾值明顯降低，血清中T-SOD 水平顯著提高，NO 水平明顯降低，耳蝸細胞氧化應激損傷減輕，聽功能改善［21］。本研究與既往研究具有相似性，本研究的結果顯示，模型組大鼠ABR 閾值明顯升高，螺旋神經節細胞超微結構明顯受損，內、外毛細胞形態紊亂，數量大量丟失，血清中T-SOD 含量降低、MDA含量升高，Nrf2 和HO-1 蛋白表達明顯下調。而經不同劑量GBE 治療后，ABR 閾值顯著降低，螺旋神經節細胞的超微結構明顯改善，內、外毛細胞形態清晰，數量呈劑量依賴性增多，血清中T-SOD 含量升高，MDA 含量降低，Nrf2 和HO-1 蛋白表達均顯著上調。

本研究應用耳蝸基底膜鋪片，Myosin-Ⅶa 標記觀察毛細胞形態和數量變化，透射電鏡觀察螺旋神經節細胞超微結構，并用免疫組化與免疫印跡法同時檢測出GBE 對各組大鼠Nrf2∕HO-1 信號通路影響，具有一定的創新性。雖然本研究對GBE治療老年性聾進行了深入探討，但導致老年性聾的病因和發病機制相對復雜，而本研究僅進行了體內實驗，未進行體外實驗，也未對相關靶點基因進行驗證，今后還需要從全方位、多層次、多角度結合更加科學、前沿的技術來闡明GBE 防護老年性聾的機制，為臨床上探索老年性聾的靶向治療藥物提供幫助與依據。

綜上所述，GBE 可延緩老年性聾的進展，其機制可能是通過Nrf2∕HO-1 信號通路提高了線粒體的功能，減輕了氧化應激對耳蝸細胞的損傷。