FTO基因DNA甲基化與乙肝疫苗免疫低/無應答水平的關系

李嘉鈴 周小婷 董柏青，2 陳欽艷 胡莉萍 王超 蘇永健 李海，2

1廣西中醫藥大學公共衛生與管理學院流行病學教研室（南寧 530200）；2廣西中醫藥大學廣西高發傳染病中西醫結合轉化醫學重點實驗室（南寧 530200）；3廣西壯族自治區疾病預防控制中心廣西病毒性肝炎防治研究重點實驗室（南寧 530029）；4廣西中醫藥大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室（南寧 530200）

持續的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染若不加以干預，將逐漸發展成肝纖維化或肝硬化，甚至最終導致肝癌。據世界衛生組織（WHO）估計［1］，接種乙肝疫苗（HepB）是預防HBV感染的最安全有效的措施。近三十年來，隨著我國將兒童HepB 接種納入了免疫規劃，新生兒出生時接種HepB 的覆蓋率較高，HBV 感染發生率呈現顯著下降趨勢，現階段人群HBV 感染率為5%～6%，5 歲以下兒童控制在0.2%左右［2］。但仍有5%～10%人群（包括部分嬰幼兒和成人）在接種HepB 后，抗?HBs 濃度<100 mUI/mL 甚至無 抗體產生，處于低/無應答狀態，從而不能有效抵御HBV 的感染［3］。

影響HepB 免疫應答水平因素有很多，其中最主要的是個體遺傳因素［4］。在表觀遺傳學研究中，DNA 甲基化對基因表達的調控起著重要作用［5］?；蛭稽c與DNA 甲基化水平有關［6］。FTO基因屬于m6A 去甲基化酶，參與m6A 調控。研究表明FTO 基因發生DNA 甲基化可引起肥胖、糖尿病、肝炎和腫瘤等一系列疾?。?-8］，其中大多與肝病有關。宿主去甲基化酶FTO 基因的DNA 甲基化水平是否會導致該酶的表達產生偏離或者錯誤，該酶的功能發生改變，從而影響m6A 修飾，導致免疫分子表達異常和HepB 免疫低/無應答的發生，目前尚未明確。本研究擬通過分析宿主去甲基化酶FTO 基因的DNA 甲基化水平與乙肝疫苗低/無應答水平之間的關聯性，為預測個體乙肝疫苗的應答水平，研發新型HepB 疫苗提供科學的依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象研究對象來源于2014-2016年間至廣西南寧市三所三級甲等醫院就診的8～9月齡263 例兒童。納入標準：（1）兒童的父母雙方均為廣西籍漢族人。（2）已按免疫程序接種三針乙肝疫苗。（3）肝功能項目正常者。（4）HBV DNA陰性者。（5）乙肝血清標記物檢測中，除抗?HBs之外，其余四項均為陰性。（6）既往無HBV 感染及其他肝炎病史。（7）未罹患先天或基礎性疾病者。排除標準：缺少以上納入標準的任意一條或多條。

1.2 方法

1.2.1 研究設計根據研究對象的抗?HBs 濃度水平進行分組：（1）抗?HBs濃度<10 mIU/mL為無應答組；（2）10 mIU/mL≤抗?HBs濃度<100 mIU/mL為低應答組；（3）100 mIU/mL≤抗?HBs濃度<1 000 mIU/mL 為正常應答組；（4）抗?HBs 濃度≥1 000 mIU/mL 為高應答組。本研究采用非匹配病例對照研究方法，將無/低應答水平（抗?HBs 濃度<100 mIU/mL）作為病例組，正常/高應答水平（抗?HBs濃度≥100 mIU/mL）作為對照組。

1.2.2 血樣采集研究對象完成乙肝疫苗免疫接種程序后的第8 周，采集其外周靜脈血10 mL，用于檢測“乙肝兩對半”、HBV?DNA 及提取DNA 進行DNA 甲基化檢測。

1.2.3 乙肝血清標記物檢測取5 mL 全血分離出血清，采用微粒子酶免疫分析法（MEIA）和全自動化學發光儀（Abbott，AX?SYM）定量檢測“乙肝兩對半”，套式PCR 法檢測HBV?DNA 。嚴格按照試劑盒說明書進行實驗的各項步驟和結果判斷。

1.2.4 血樣DNA提取及濃度測定取另外5 mL全血，采用Trizol 法提取DNA。取5 μL 擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠圖像成像系統中觀察基因組DNA 的完整性：電泳條帶清晰可見，無明顯降解和RNA 污染；采用超微量分光光度計檢測基因DNA 質量：檢測DNA 濃度≥20 ng/μL，總量≥1 μg，OD260/280=1.7～2.0，OD260/230≥1.8。

1.2.5 引物設計與單位點PCR 條件優化采用上海天昊科技公司的專利軟件，針對目標區域設計和優化多重PCR 引物。

1.2.6 重亞硫酸鹽轉化測序技術（BS?Seq）采用EZ DNA 甲基化試劑盒對DNA 進行重亞硫酸鹽處理，將基因組中未被甲基化修飾的DNA 胞嘧啶C轉變為尿嘧啶U。以優化后的多重PCR 引物為模板對經過重亞硫酸鹽轉化后樣本目標片段進行多重PCR 擴增。

1.2.7 樣本添加特異性標簽序列與上機測序通過11 個循環數PCR 擴增技術將帶有Index 序列的引物引入文庫末端并添加特異性標簽序列。將所有樣品Index PCR 擴增產物等量混合后割膠回收，獲得Methyl Target 測序數據庫。確定產物濃度后以2×150 bp 的雙端測序模式通過Illumina Hiseq平臺，進行高通量測序并獲得數據。

1.3 統計學方法采用IBM SPSS 20.0 軟件對數據進行統計學分析，年齡符合正態分布，兩組間年齡的比較用t檢驗。FTO 基因甲基化水平經正態性檢驗發現不符合正態分布，用中位數（M）和四分位距（IQR）進行描述。采用Mann?WhitneyU檢驗，比較觀察（低/無應答）組和對照（正常/高應答）組FTO 基因DNA 甲基化水平的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

1.4 倫理審查本研究已通過廣西倫理委員會的倫理審查（IRB SQ/01.01/02），研究對象的父母已知曉相關研究內容、目的并簽署知情同意書。

2 結果

2.1 研究對象基本情況本研究共納入263 例8～9月齡的廣西漢族兒童作為研究對象，其中男童、女童分別為228 名（228/263，86.7%）、35 名（35/263，13.3%）；乙肝疫苗無、低、正常、高應答者分別為8 例（8/263，3.0%）、96 例（96/263，36.5%）、68 例（68/263，25.9%）、91 例（91/263，34.6%）；病例組104 例（104/263，39.5%），對照組159 例（159/263，60.5%）。觀察組和對照組的性別（χ2=-0.004，P=0.953）和年齡（t=-0.08，P=0.930）構成比之間的差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

表1 研究對象基本情況及抗?HBs 免疫應答水平分布Tab.1 Basic information and anti?HBs immune response level distribution of subjects

2.2 病例組和對照組FTO 基因DNA 甲基化水平比較分析觀察組和對照組FTO 基因28 個位點CpG 島DNA 甲基化情況與HepB 免疫應答水平的關系，結果顯示：FTO 基因各基因位點的DNA 甲基化水平都比較低。觀察組和對照組的DNA 甲基化水平 在FTO_1 基因222 位點、FTO_2 基因72 位 點的差異具有統計學意義。觀察組FTO_1 基因222位點的DNA 甲基化水平高于對照組（Z=-2.38，P=0.009）。觀察組FTO_2 基因72 位點的DNA 甲基化水平高于對照組（Z=-1.71，P=0.044）。見表2。

表2 病例組和對照組FTO 基因DNA 甲基化水平比較Tab.2 Comparison of FTO gene DNA methylation levels between the case group and the control groupM（P25，P75）

2.3 病例組與對照組FTO_1基因222位點、FTO_2基因72 位點的DNA 甲基化水平差異情況檢測研究對象外周靜脈血FTO_1 基因的222 位點和FTO_2 基因的72 位點的DNA 甲基化水平，以CpG位點為單位，通過boxplop 散點圖表示觀察組和對照組DNA 甲基化水平情況。見圖1-2。

圖1 觀察組與對照組FTO_1 基因222 位點的DNA 甲基化水平差異情況Fig.1 Differences in DNA methylation levels of FTO_1 gene locus 222 between the case group and the control group

3 討論

DNA 甲基化可通過改變基因的結構［9］、干擾轉錄因子［10］、改變染色體的形態［11］等影響蛋白質的表達，從而影響著人體的生理、病理活動。在許多疾病中，比如腫瘤，抑癌基因的啟動子區通常發生了大量的?CH3修飾，導致轉錄出現障礙。在HBV感染的肝癌患者中腫瘤啟動子區發生?CH3修飾水平明顯高于慢性肝炎的患者［12］?？梢姡拗骰駾NA 甲基化在腫瘤、慢性肝炎等疾病中發揮著重要的作用，但未見DNA 甲基化與乙肝疫苗低/無應答的相關報道。

圖2 觀察組與對照組FTO_2 基因72 位點的DNA 甲基化水平差異情況Fig.2 Differences of DNA methylation levels of FTO_2 gene locus 72 between the case group and the control group

m6A 發生甲基化，可以影響DNA 完成轉錄后調控基因的表達和mRNA 的構型變化、解讀及運轉。FTO 酶作為m6A 去甲基化酶，在m6A 調控中是不可缺少的。有研究顯示［13］肝細胞癌患者m6A甲基化水平均高于健康者；FTO 基因低表達水平預示肝癌良好的預后，降低FTO 表達后肝細胞繁殖的增加［14］。FTO 基因的rs9939609A 變異患者中肝炎的患病率更高［15］。FTO 基因rs1421085 的C、rs8050136 的A、rs3751812 的T 和rs9939609 的A 變異均與脂肪性肝?。∕AFLD）風險升高相關［16］?？梢?，FTO 基因的DNA 甲基化水平會影響肝癌、肝炎、脂肪性肝病等肝類疾病的發生發展，但宿主FTO 基因DNA 甲基化水平是否會影響RNA 的轉錄調控和蛋白表達，從而影響m6A 修飾，導致免疫分子表達異常和HepB 免疫低/無應答的發生，目前未見相關報道?；谝陨嫌^點，猜測去甲基化酶FTO 基因發生DNA 甲基化后，可能會導致該酶的表達產生偏離或者錯誤，酶的功能發生改變，影響m6A 修飾調控作用，從而影響機體免疫系統，導致乙肝疫苗低/無應答現象的發生。

為了驗證這一猜測，本研究采用非匹配病例對照的研究方法，對263 例8～9月齡廣西漢族兒童進行FTO 基因DNA 甲基化水平測定，分析其與乙肝疫苗免疫應答水平的關聯性。結果顯示：FTO基因各基因位點的DNA 甲基化水平都比較低；觀察組和對照組的DNA 甲基化水平在FTO_1 基因222 位點、FTO_2 基因72 位點的差異具有統計學意義；觀察組FTO_1 基因222 位點的DNA 甲基化水平高于對照組；觀察組FTO_2 基因72 位點的DNA甲基化水平高于對照組。這提示人體中FTO 基因存在發生甲基化的可能，乙肝疫苗接種者免疫低/無應答水平可能受FTO_1 基因222 位點、FTO_2 基因72 位點的影響。由此，推測FTO 基因作為去甲基化酶，通過DNA 甲基化修飾后可能使酶的結構發生改變和相應的功能也隨之發生改變，導致m6A RNA 甲基化修飾出現異常，影響RNA 的轉移、穩定、翻譯、降解等過程，從而影響蛋白質的合成，可能使宿主免疫調節分子的基因表達發生改變，引起HepB 接種者免疫低/無應答水平的發生。

本研究存在一定的局限性和不足之處。第一，研究樣本量較小，研究對象局限于廣西漢族兒童，研究地區局限于廣西南寧市三所醫院；第二，未收集兒童的出生體質量、身長、疾病狀況、營養狀況、分娩方式等其他可能的影響因素；第三，未能對FTO 基因發生DNA 甲基化的靶基因mRNA 表達進行驗證。因此，本次研究可能會存在一定的選擇偏倚和混雜偏倚。在今后研究中，應擴大樣本量和研究對象范圍，選取多家醫院或社區開展研究，開展相關的動物體內、體外試驗，通過敲除或過表達去甲基化酶FTO 基因，進一步深入探討靶基因mRNA 表達和乙肝疫苗免疫應答水平的關系，從而預測個體乙肝疫苗免疫應答的水平，為研發新型疫苗提供依據。