寧夏地區規模牧場金黃色葡萄球菌的分離鑒定與藥敏試驗

張立強，雷 靜

寧夏農墾賀蘭山奶業有限公司，寧夏銀川 750011

0 引言

在奶牛養殖業中，乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，根據發病原因可以分為環境性乳房炎和傳染性乳房炎。傳染性乳房炎通常由大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等細菌導致[1]，其中金黃色葡萄球菌引起的乳房炎導致的奶牛死淘率最高且治療困難，給養殖業造成了極大損失[2]。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界中的空氣、土壤、水等環境中[2]。研究表明，由金葡菌引起的奶牛乳房炎感染情況僅低于大腸桿菌[3，4]。金黃色葡萄球菌可以損害乳房上皮細胞和腺泡的功能，使奶產量迅速下降，嚴重威脅奶牛健康和牧場的經濟效益。此外，金黃色葡萄球菌也可經傷口進入犢牛血液，導致犢牛發生菌血癥，感染眼部發生結膜炎[6]，嚴重時可透過血腦屏障導致犢牛發生腦膜炎[5]。為此，本研究通過流行病學調查、實驗室診斷及分子生物學鑒定等方法對寧夏地區的規模牧場進行金黃色葡萄球菌流行情況的調查，并對分離菌進行了耐藥性分析，為寧夏地區金黃色葡萄球菌導致乳房炎的預防提供合理的用藥指導。

1 材料

1.1 試劑

LB肉湯培養基、甘露醇高鹽瓊脂培養基、革蘭氏染色液，珠海貝索生物技術有限公司；2×TaqPlus Master mix Ⅱ，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Trans DNA Maker Ⅰ，北京全式金生物技術有限公司；SuperRde核酸染液，合肥蘭杰柯科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，京天根生化科技有限公司；藥敏試紙，杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 儀器

光學顯微鏡，Olympus公司；高壓滅菌器，Hirayama公司；電子分析天平、電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；恒溫培養箱，北京市永光明醫療儀器廠；超凈工作臺，上海鴻都電子科技有限公司；離心機，Sigma公司；隔水式恒溫培養箱、全自動振蕩培養箱，北京市永光明醫療儀器廠；PCR擴增儀，Techne公司；電泳儀，北京市六一儀器廠；牛博士Ⅲ型體細胞檢測儀器，華誠睿光（中國）生物科技有限公司。

2 方法

2.1 樣品采集

2021年7—10月，從寧夏地區銀川市、石嘴山市、吳中市、中衛市的6 個存欄2 000 頭以上的規模牧場中采集奶樣856 份，見表1。

表1 各牧場采集的奶牛頭數

具體步驟：根據各牧場的DHI數據和牧場管理軟件系統，篩選出體細胞數≥300 萬個/mL的臨床型乳房炎奶牛進行奶樣采集，-4 ℃保存運輸。

2.2 金黃色葡萄球菌的分離

取50 μL充分混勻的奶樣，無菌接于含有1 mL的LB肉湯培養基的試管中，180 r/min、37 ℃振蕩培養18~24 h后，劃線于甘露醇高鹽瓊脂培養基，挑取形態相似的菌落接種于1 mL的LB肉湯培養基內，進行純化，2 次后，挑取單菌落、進行涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。

2.3 PCR 鑒定

將菌落形態與金黃色葡萄球菌描述一致，且鏡檢觀察結果為革蘭氏陽性球菌的菌液樣品按照DNA提取試劑盒描述步驟進行DNA提取。金黃色葡萄球菌特異性鑒定引物反應條件參考相關文獻[7]，見表2。

表2 PCR擴增條件及引物序列

2.3 分離菌株的藥物敏感性試驗

采用革蘭氏陽性球菌敏感性藥物頭孢噻肟、青霉素、萬古霉素、鏈霉素、慶大霉素、諾氟沙星、丁胺卡那霉素、氨芐西林、四環素、阿莫西林、環丙沙星等。取50 μL純化后的金黃色葡萄球菌菌液滴在貼有7 種不同藥敏紙片的LB瓊脂培養基上，每個藥敏紙片之間的距離≥24 mm，置于37 ℃恒溫培養箱中培養18~24 h后進行觀察，并測量LB瓊脂平皿上形成的抑菌環大小。細菌對每種藥物的敏感程度按照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）藥敏試驗標準進行判斷。

3 結果與分析

3.1 金黃色葡萄球菌鑒定結果

甘露醇高鹽培養基為金黃色葡萄球菌選擇培養基，在該平皿上長出的為金黃色葡萄球菌菌落（圖1）。金黃色葡萄球菌經革蘭氏染色后，在顯微鏡下可以觀察到排列呈葡萄串狀，無芽孢、鞭毛、莢膜的革蘭氏陽性球菌（圖2）。

圖1 甘露醇高鹽瓊脂培養基

圖2 金葡菌鏡檢圖片（1 000×）

3.2 PCR 鑒定結果

6 個規模牧場所采集的856 份奶樣經PCR鑒定為金黃色葡萄球菌的共有467 株。其中A場73 株、B場67 株、C場77 株、D場82 株、E場93 株、F場75 株。擴增所產物大小與預期一致，為233 bp（圖3）。

3.3 藥物敏感性試驗結果

金黃色葡萄球菌對環丙沙星、萬古霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、鏈霉素高度敏感（表3）。

表3 不同藥物對金黃色葡萄球菌的平均抑菌直徑

4 討論

金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎防控的瓶頸是每次治療都可導致大量耐藥性菌株的出現，因此檢測菌株對藥物的敏感性可以為獸醫工作者選擇適合的治療藥物提供有效的依據[8]。乳房炎在牧場中是非常常見的疾病，使用合理，科學的方案進行預防、治療乳房炎顯得非常重要，如治療時應選擇高度敏感性藥物并且輪換使用，以此來減少耐藥性的發生[9，10]。為了降低乳房炎造成的經濟損失，牧場應加強飼養管理，定期對圈舍環境消毒，保證墊草干燥，提供高質量、營養全面的飼料。

本次試驗共采集奶樣856 份，其中經革蘭氏染色和顯微鏡鏡檢后革蘭氏陽性球菌共811 株，分離率達95 %，通過PCR鑒定共得到金黃色葡萄球菌467 株，陽性率達55%；藥敏試驗結果顯示，分離出的金黃色葡萄球菌對環丙沙星、萬古霉素、慶大霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、鏈霉素敏感，可以作為首選藥物，為寧夏地區牧場預防金黃色葡萄球菌乳房炎提供了科學的依據。