基于人工神經網絡算法的2株木質素降解菌固體菌劑的制備

李雅琳，李素艷，孫向陽，郝 丹，蔡琳琳，常曉彤

（北京林業大學 林學院，北京 100083）

園林綠化廢棄物資源化利用[1-2]已成為研究熱點，其中堆肥化是一種比較理想的處理方式。由于園林綠化廢棄物木質素含量較高、起始微生物數量較少等原因，堆肥效率較低，因此如何提高堆肥過程中的微生物數量成為推進園林綠化廢棄物堆肥的關鍵[3-4]。添加微生物菌劑是提高堆體微生物數量最直接的方式之一。目前，針對木質素降解的菌劑較少，且多集中于液體菌劑。然而液體菌劑對無菌條件要求較高，運輸及產品儲存有諸多不便[5]。固體菌劑在生產和儲存方面能彌補液體菌劑的不足，同時，固體菌劑生產成本更低、生產工藝也相對簡單，對促進園林綠化廢棄物堆肥化過程的優勢更明顯[6]。生產固體菌劑，除了設計固體發酵的培養基，還要優化其發酵條件，主要流程為試驗設計、數學建模和優化設計3個部分[7]。合理的試驗設計能用較少的試驗數據進行建模，從而獲取各因素范圍內的最優解。已有研究對于固態發酵的優化多是使用響應面法[8-9]。但是有研究發現[10]：人工神經網絡算法優化培養基比響應面法優化培養基驗證結果更準確，誤差更小。本研究擬采用單因素試驗和正交試驗確定作為固態發酵培養基碳源、氮源的較優種類和水平，然后根據碳氮源優化結果，通過單因素試驗確定外加營養組分種類，最后采用均勻實驗結合人工神經網絡建模與優化，尋找2株木質素降解菌的外加營養組分接種量和最佳固體培養基發酵條件，以期得到最大發酵生物量，制作高效固體菌劑用于園林綠化廢棄物堆肥。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株A為構巢曲霉Aspergillus nidulans、菌株Q為栓菌屬1種Trametessp.，均由北京林業大學土壤生物學實驗室分離并保藏。

PDA培養基：馬鈴薯浸汁(200.000 g土豆去皮去芽，切成小塊，加蒸餾水1 L保持微沸30 min后過濾)，葡萄糖 20.000 g，蛋白胨 15.000 g，瓊脂 20.000 g，pH 自然。PDB 液體培養基：馬鈴薯浸汁 (同PDA培養基)，葡萄糖 20.000 g，蛋白胨15.000 g，pH自然。以上所有培養基均121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養 ①菌株活化。將接種環置于酒精燈上燃燒，待冷卻后挑取PDA斜面上的少許菌株接種至PDA培養基，封口后置于恒溫培養箱活化。②液體菌種培養。將活化后純培養的目標菌株的PDA培養基接至放有玻璃碎片的PDB液體培養基的三角瓶中，在IS-RDD3臺式恒溫振蕩器中以25 ℃、200 r·min-1條件下培養5 d。③固態發酵。以30.000 g麩皮為發酵基質，添加碳氮源以及外加營養組分，于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后，冷卻至室溫備用。將液體菌種按20%的接種量(物料干質量)加入無菌水中混勻，接入物料，調節料水比，攪拌均勻后置于25 ℃條件下培養7 d，重復3次。

1.2.2 制作固態發酵培養基 ①碳氮源篩選。采用單因素試驗篩選固體發酵培養基的碳氮源種類。以麩皮為發酵基質，在米糠、木質素磺酸鈉、玉米粉、蔗糖中篩選碳源，在豆餅粉、蛋白胨、酒石酸胺、尿素中篩選氮源，比較不同碳氮源對2株木質素降解菌生物量的影響，以選擇能促進菌體生長發育的最佳碳氮源。采用L9(34)正交試驗確定最佳添加量。根據最佳碳氮源的篩選結果，選擇3個吸光度D(260)相對較高的添加量梯度進行L9(34)正交試驗，探究碳氮源添加量對2株木質素降解菌生物量的影響，優化固態發酵基質配方。②外加營養組分篩選。采用單因素試驗確定添加物質種類。以麩皮為發酵基質，在最佳碳氮源的基礎上中添加營養組分：硫酸鈣(CaSO4)、硫酸鎂(MgSO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、氯化鈉(NaCl)進行外加營養組分篩選，重復3次，選擇3個D(260)最大的作為外加營養組分的種類，確定外加鈣鹽、鎂鹽、磷酸鹽等對菌株A和菌株Q生長的影響。③培養基配方優化。采用均勻實驗設計結合人工神經網絡建模，進一步優化固態發酵培養基的外加營養組分添加量及其他發酵條件。

1.2.3 菌絲生物量的測定 將液體菌種用紗布過濾，同時以無菌水充分洗滌過濾物，過濾物即為純菌體，在65 ℃的條件下烘干至恒量，留存備用。精密稱取純菌體0.010、0.030、0.050、0.100、0.150和0.200 g，加入25.000 mL體積分數為5%三氯乙酸溶液，80 ℃恒溫水浴中攪拌提取25 min，取出后冰浴冷卻，在4 ℃、8000 r·min-1條件下離心15 min，稀釋2倍，以體積分數為5%的三氯乙酸為對照，用分光光度計測定D(260)，構建標準回歸曲線。發酵物置于65 ℃條件下烘干至恒量，取0.500 g烘干至恒量的固態發酵物測定D(260)(與上述提取純菌體中核酸的方式相同)。同時，以發酵7 d但未接種種子液的固態發酵物作為空白對照，在260 nm處測定提取液的D(260)，通過標準回歸曲線預測菌絲干質量。

1.2.4 數據統計與分析 ①數據采用 Excel 2007 和 SPSS 22.0 處理。碳氮源優化用單因素方差分析法，平均值多重比較用LSD最小顯著性差異法(P＜0.05)。②采用均勻實驗實現人工神經網絡建模與優化。其一，基于SmoothL1損失函數的人工神經網絡構建。該網絡借鑒U-Net架構設計了編碼器和解碼器，添加了殘差連接[11]，以緩解網絡退化問題[12]，并采用SmoothL1損失函數[13]最小化觀察值與模型預測值的誤差。損失函數如下所示：其二，基于AdamW算法[14]尋優。神經網絡、AdamW算法基于Pytorch[15]實現。

2 結果與討論

2.1 純菌絲干質量和核酸量的線性關系

由圖1可知：2株木質素降解菌菌絲中的核酸量與菌絲干質量在測試的范圍之內可呈現良好的線性關系，說明通過測定D(260)來確定2株木質素降解菌固態發酵生物量的方法可行。菌株Q的線性方程為yQ=4.349 3x+0.044 6，R2=0.998 6；菌株 A 的線性方程為yA=4.081 4x+0.046 3，R2=0.995 7。

圖1 菌絲中核酸量與菌絲干質量的關系Figure 1 Relationship between the amount of nucleic acid in mycelium and the amount of mycelium

2.2 固體發酵培養基的篩選

2.2.1 碳源對2株木質素降解菌生物量的影響 由圖2可知：菌株A的4種碳源處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但木質素磺酸鈉的D(260)最高，分別較米糠、玉米粉和蔗糖處理高出14.900%、8.800%和8.200%。菌株Q的3種碳源處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但玉米粉的D(260)最高，分別較木質素磺酸鈉、米糠和蔗糖處理高出6.900%、3.600%和0.900%。菌株A為構巢曲霉，分泌的木質素降解相關酶系降解木質素效果顯著[16-17]，同時木質素磺酸鈉是木質素磺化改性得到的衍生化產品，因此，相比其他3種碳源，木質素磺酸鈉更有利于促進菌株A細胞的快速生長，獲得較高的菌絲生物量[18]。菌株Q在以玉米粉為碳源時的生物量最高，可能是因為玉米粉中含有大量的糖分、淀粉、多種礦質元素和維生素, 這些營養物質有利于菌株Q的生長繁殖[19]。因此，選擇木質素磺酸鈉作為菌株A的碳源，選用玉米粉作為菌株Q的碳源。

圖2 碳源對 2 株木質素降解菌生物量的影響Figure 2 Effect of carbon source on the biomass of two lignindegrading bacteria

2.2.2 氮源對 2 株木質素降解菌生物量的影響 由圖3可知：菌株A的4種氮源處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但豆餅粉的D(260)最高，分別較蛋白胨、酒石酸胺和尿素處理高出4.300%、3.000%和15.600%。菌株Q的D(260)在以豆餅粉為氮源時最高，且與其他處理差異顯著(P＜0.05)，分別較蛋白胨、酒石酸胺和尿素處理高出6.700%、8.200%和14.400%。豆餅粉含大量碳水化合物、蛋白質及少量異黃酮類物質和可溶性多糖，可作為發酵的氮源及生長因子，有利于生物量的積累[20-21]。同時，豆餅粉來源穩定，價格低廉，能夠快速被微生物利用，因此，選用豆餅粉為后續實驗中菌株A和菌株Q的氮源。

圖3 氮源對 2 株木質素降解菌生物量的影響Figure 3 Effect of nitrogen source on the biomass of two lignindegrading bacteria

2.2.3 碳氮源添加量對2株木質素降解菌生物量的影響 由圖4所示：菌株A在以木質素磺酸鈉為最佳碳源時，添加量為2.500%、5.000%、10.000%處理間的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但是數值相對較高。因此，菌株A的木質素磺酸鈉選用2.500%、5.000%、10.000%添加量進行正交試驗。菌株Q在以玉米粉為最佳碳源時，添加量為5.000%時D(260)值最高，與其他處理差異顯著(P＜0.05)，0.625%、2.500%的D(260)也相對較高，因此，菌株Q的玉米粉選用0.625%、2.500%、5.000%添加量進行正交試驗。菌株Q在添加量為5.000%時生物量達到最高，可能是由于在培養空間一定時，玉米粉的添加量越多，通氣量降低，導致生物量的積累下降從而使菌株Q的生長受到了一定的抑制[16]。由圖5可知：菌株A以豆餅粉為最佳氮源時，5種不同添加量處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)。添加量為10.000%時D(260)最高，但是從經濟角度考慮，最終選擇豆餅粉添加量為1.250%、2.500%、5.000%進行正交試驗。菌株Q以豆餅粉為最佳氮源時，添加量為1.250%、5.000%、10.000%時的D(260)顯著高于另外2個添加量，因此選擇這3個梯度進行正交試驗。

圖4 碳源添加量對 2 株木質素降解菌生物量的影響Figure 4 Effect of carbon source addition on the biomass of two lignindegrading bacteria

圖5 氮源接種量對 2 株木質素降解菌生物量的影響Figure 5 Effect of nitrogen source inoculum on the biomass of two lignin-degrading bacteria

2.2.4 正交試驗 由表1和表2可知：菌株A的碳氮源添加量為木質素磺酸鈉5.000%、豆餅粉5.000%時D(260)最大，高達0.249。菌株Q的碳氮源添加量為玉米粉0.625%、豆餅粉10.000%時D(260)最大，高達0.261。因此選定菌株A的碳氮源添加量為木質素磺酸鈉5.000%和豆餅粉5.000%，菌株Q的碳氮源添加量為豆餅粉10.000%和玉米粉0.625%。

表1 菌株 A 正交設計試驗 L9(34)Table 1 Orthogonal design experiment of strain A L9 (34)

表2 菌株 Q 正交設計試驗 L9(34)Table 2 Orthogonal design experiment of strain Q L9 (34)

2.3 外加營養組分篩選

由圖6表明：菌株A的5種外加營養組分處理的D(260)差異不顯著(P＞0.05)，但外加CaSO4、MgSO4、KH2PO4時的D(260)值最大，因此，這3種被定為最佳外加營養組分。微生物除了碳源和氮源，還需要一定量的無機鹽來調節其生長代謝。鎂鹽作為許多重要酶的激活劑能夠影響蛋白質的合成以及基質氧化；磷則是核酸和蛋白質的重要組成成分，能夠影響微生物的生長[22]，這與本研究結果一致。

圖6 菌株 A 和菌株 Q 在不同營養組分培養基上的生長Figure 6 Growth of strain A and strain Q on the medium with different nutrient components

2.4 均勻實驗結合人工神經網絡建模與優化

在以2.2.4和2.3實驗結果為前提的條件下，設計6因素5水平10組的均勻實驗。再通過神經網絡對所有數據進行預測，得到實測值與仿真值的對比(表3和表4)。結果發現：各觀察值與測量值誤差較小，基本相同。綜上，該模型預測值具備參考性。

表3 菌株 Q 均勻實驗設計及結果Table 3 Strain Q uniform test design and results

表4 菌株 A 均勻試驗設計及結果Table 4 Strain A uniform test design and results

2.5 菌株在優化后固體發酵培養基上的生長情況

如表5所示：按照人工神經網絡算法模型預測的優化后固體發酵培養基進行實驗驗證，該優化條件下菌株 Q 的D(260)為 0.6020，實測值為 0.5960，誤差為1.000%；預測得到菌株A的D(260)為0.4850，實測值為0.4780，誤差為1.500%。

表5 人工神經網絡尋優結果Table 5 Optimization results of artificial neural network

3 結論

本研究結果表明：人工神經網絡算法優化后菌株Q的預測值為0.6020，實測值為0.5960，誤差為1.000%；菌株A的預測值為0.485，實測值為0.478，誤差為1.500%。基于人工神經網絡構建的模型擬合度較好。

根據單因素試驗和人工神經網絡算法結果，確定了2株木質素降解菌的最優固體發酵條件。菌株Q：固體菌劑培養基基質為麩皮30.000 g作為基底，添加豆餅粉10.000%和玉米粉0.625%，外加營養組分為MgSO41.434%、KH2PO40.115% 和FeSO4·7H2O 1.497%；接種條件為接菌量 6.000%、料水比1.000∶0.992、保護劑1.000%。菌株A：固體菌劑培養基基質為麩皮30.000g作為基底，添加豆餅粉5.000% 和木質素磺酸鈉為 5.000%，外加營養組分為 MgSO40.123 %、KH2PO40.213 %、FeSO4·7H2O 1.280%；接種條件為接菌量21.000%、料水比1∶1、保護劑19.000%。