黃瓜AQP基因家族的鑒定與生物信息學(xué)分析

賴夢(mèng)霞，杜長(zhǎng)霞，樊懷福

（浙江農(nóng)林大學(xué) 園藝科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 311300）

植物常遭受由生物或非生物環(huán)境因子所帶來的傷害。脅迫因子在抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)，亦觸發(fā)其系統(tǒng)性防御反應(yīng)。例如，為適應(yīng)干旱脅迫，植物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中演化出一系列調(diào)控水分吸收、關(guān)閉氣孔降低水分散失量等機(jī)制。深入了解植物對(duì)外界的防御反應(yīng)，對(duì)提高植物抗性和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的意義。目前，研究者已在不同植物中發(fā)現(xiàn)多個(gè)響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的基因家族，如荔枝Litchi chinensis Dof基因家族[1]、黃瓜Cucumis sativus DnaJ基因家族[2]、水稻Oryza sativa ABC1基因家族[3]及MIP基因家族等。其中MIP家族的各種蛋白質(zhì)成員具有獨(dú)特和特定的運(yùn)輸功能，是近年來的研究熱點(diǎn)。水通道蛋白(AQP)家族屬于跨膜通道蛋白MIP超家族[4]。大量研究表明：AQP參與水分子跨膜、調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透勢(shì)及響應(yīng)多種逆境脅迫。AQP已知分類主要為PIPs (plasma membrane intrinsic proteins)、TIPs (tonoplast intrinsic proteins)、NIPs (noduLin 26-like intrinsic proteins)、SIPs (small and basic intrinsic proteins)、 XIPs (uncharacterized intrinsic proteins)以 及 HIPs (hybrid intrinsic proteins)、GIPs(glycerolfacilitato)[5]。 POU等[6]研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥Arabidopsis thaliana中ATPIP2;7在鹽脅迫后，表達(dá)豐度降低；煙草Nicotiana tabacum中NtPIP1;1和NtPIP2;1在植株根系的水分運(yùn)輸中起重要作用[7]; 擬南芥ATPIP2;1在脅迫條件下，其胞吞作用受到不同程度的影響[8]；煙草NtAQP1參與二氧化碳的滲透[9]；擬南芥[10]、玉米Zea mays[11]等植物的TIP亞家族參與植物跨細(xì)胞長(zhǎng)距離運(yùn)輸水分的過程。隨著越來越多物種的測(cè)序的完成，在擬南芥、水稻等模式植物上的AQP基因家族信息已比較明確，在番茄Lycopersicon esculentum[12]、龍眼Ferocactus viridescens[13]等植物中也識(shí)別出許多AQP基因家族。黃瓜是世界性的重要蔬菜作物，但因其根系分布較淺，因此對(duì)水分、鹽漬化等脅迫敏感。本研究采用生物信息學(xué)方法得到33個(gè)CsAQP基因家族的氨基酸序列，在染色體上定位了CsAQP基因家族，對(duì)編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等進(jìn)行分析比較，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，為CsAQP基因功能研究和響應(yīng)逆境機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

所用各物種AQP基因家族數(shù)據(jù)及黃瓜基因組數(shù)據(jù)集均來源于美國國家生物信息中心 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，并從Pfam數(shù)據(jù)庫中下載種子文件PF00230，于BIO-Linux系統(tǒng)中使用hmmsearch掃描黃瓜蛋白數(shù)據(jù)庫，得到含MIP蛋白保守結(jié)構(gòu)域的基因[14]。運(yùn)用Perl程序?qū)ζ溥M(jìn)一步篩選(e值為1E-20)，利用hmmbuild構(gòu)建蛋白質(zhì)特異保守結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型。基于新隱馬可夫模型，使用hmmsearch再次掃描黃瓜蛋白數(shù)據(jù)庫，保留結(jié)果。同時(shí)，以擬南芥AQP基因家族序列及番茄、馬鈴薯Solanum tuberosumXIPs序列為檢索靶標(biāo)，BLAST搜索黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(e值為1E-10)。兩方面匹配所得的序列取并集(同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本，僅擇其一)當(dāng)作CsAQP候選。所有候選AQP分別被提交至Interpro數(shù)據(jù)庫及美國國家生物信息中心CDD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，剔除冗余和不匹配的氨基酸序列，最終獲得CsAQP基因家族成員。

1.2 CsAQP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過ClustalW對(duì)黃瓜、模式植物擬南芥和水稻的AQP家族成員以及番茄、馬鈴薯XIPs序列進(jìn)行比對(duì)[15]，采用 MEGA-7 的最大似然法 (maximum likelihood, ML)，將自展法系數(shù) (Booststrap)設(shè)置為 1 000次，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)合基因注釋信息及物種進(jìn)化結(jié)果，參考其他植物水通道蛋白命名法對(duì)CsAQP基因家族成員系統(tǒng)命名。

1.3 CsAQP家族成員的定位及基本性質(zhì)分析

通過篩選到的CsAQP基因的序列信息，利用MG2C軟件將其定位于染色體上。采用ExPASy-ProtParam在線預(yù)測(cè)CsAQP蛋白的分子量、電荷殘基數(shù)、分子式、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)及脂肪系數(shù)；利用ExPASy-ProtScale在線分析其親/疏水性；使用Plant-mPLoc 2.0預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；使用SignalP-5.0預(yù)測(cè)其信號(hào)肽；采用TMHMM-2.0預(yù)測(cè)分析其跨膜結(jié)構(gòu)。

1.4 CsAQP 蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用SOPMA對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并基于SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模。

1.5 CsAQP家族成員的基因結(jié)構(gòu)及基序分析

通過GSDS 2.0可視化CsAQP基因家族成員的內(nèi)含子-外顯子的分布，并利用MEME 5.3.3在線工具對(duì)CsAQP家族蛋白的保守基序進(jìn)行分析，限值為15。采用TBtools繪制示意圖。

1.6 CsAQP 的保守序列頻率分析

利用DNAMAN對(duì)CsAQP蛋白成員進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用weblogo在線軟件繪制seqlogo圖，其特征高度反映相對(duì)的變化頻率。

1.7 CsAQP基因家族上游的順式元件預(yù)測(cè)

從黃瓜基因組中提取CsAQP家族成員起始密碼子上游1 500 bp的序列，利用Plant CARE數(shù)據(jù)庫分析啟動(dòng)子順式作用元件；利用TBtools對(duì)其結(jié)果可視化。

1.8 CsAQP家族成員的重復(fù)及選擇壓力分析

提取轉(zhuǎn)錄本的CDS序列，建立目標(biāo)序列數(shù)據(jù)庫，多序列比對(duì)，構(gòu)建索引，運(yùn)行Perl程序，進(jìn)一步篩選比對(duì)結(jié)果(篩選標(biāo)準(zhǔn)：序列兩兩之間的相似性大于75%，且2條序列比對(duì)上的長(zhǎng)度大于較長(zhǎng)序列的75%[16])，最終獲得串聯(lián)重復(fù)基因?qū)Α２捎肅lustalW對(duì)各對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因進(jìn)行全序列比對(duì)，并使用KaKs_Calculator 2.0計(jì)算其同義替換和非同義替換間的比率。

1.9 CsAQP 蛋白成員的互作預(yù)測(cè)

使用STRING對(duì)黃瓜AQP蛋白成員進(jìn)行互作預(yù)測(cè)，選取模式植物擬南芥作為參考，探究CsAQP蛋白之間的作用關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsAQP家族的全基因組鑒定及多物種進(jìn)化分析

通過黃瓜完備基因集與參考基因集BLAST比對(duì)，并利用Domain HMM模型進(jìn)行HMMRER搜索，兩者取并集[15]。篩選鑒定其含有特定結(jié)構(gòu)域的序列，最終獲得33個(gè)CsAQP基因家族成員。通過ClustalW對(duì)黃瓜、擬南芥和水稻的AQP家族成員以及番茄、馬鈴薯XIPs序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示：CsAQP基因家族成員被分成5個(gè)亞家族，分別為PIP、NIP、TIP、SIP、XIP。其中，PIP亞族的CsAQP基因家族成員數(shù)量最多，有14個(gè)成員；NIP與TIP亞族的CsAQP基因家族成員數(shù)量等同，均為8個(gè)；SIP亞族有2個(gè)成員；XIP亞族的數(shù)量最少，僅1個(gè)成員。黃瓜水通道蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化聚類模式與參考植物相似，大部分CsAQP基因家族成員呈現(xiàn)出與同一亞家族中的其他成員聚集的趨勢(shì)。根據(jù)多物種進(jìn)化結(jié)果和黃瓜單物種進(jìn)化結(jié)果，結(jié)合已有的同源基因?qū)sAQP基因家族成員命名。具體結(jié)果見表1。

表1 CsAQP基因家族的命名及理化性質(zhì)分析Table 1 Nomenclature and physicochemical properties analysis of CsAQP gene family

2.2 CsAQP基因家族的理化性質(zhì)分析

理化性質(zhì)分析(表1和表2)發(fā)現(xiàn)：CsAQP家族成員編碼191～319個(gè)氨基酸，分子量為20.26～34.47 kDa，僅CsNIP亞族的氨基酸數(shù)目與分子量呈正相關(guān)；其電荷殘基數(shù)差異較大，理論等電點(diǎn)為5.30～10.00，多數(shù)CsAQP家族成員富含堿性氨基酸。除CsXIP1;1外，其余CsAQP家族成員蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為23.72～39.31，小于40.00，為穩(wěn)定蛋白。所有成員具有相對(duì)較高的脂肪系數(shù)，有利于其在應(yīng)對(duì)環(huán)境變化中正常發(fā)揮功能。CsAQP家族成員含4～7個(gè)跨膜域，多數(shù)成員含6個(gè)。Plant-mPLoc 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：大部分成員主要定位于細(xì)胞膜，少數(shù)位于液泡，個(gè)別為兩者皆有。SignalP-5.0和ExPASy-ProtScale在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明：上述33個(gè)CsAQP家族基因均無信號(hào)肽，具疏水性。

表2 CsAQP基因家族的亞細(xì)胞定位及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Table 2 Subcellular localization and transmembrane structure prediction of CsAQP gene family

2.3 蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，預(yù)測(cè)所得結(jié)構(gòu)單元有4種(圖1)，分別為α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：33條氨基酸序列中，CsNIP4;1、CsPIP2;5、CsSIP1;1、CsSIP2;1、CsXIP1;1以α-螺旋為主要組成部分，其余28個(gè)成員則以無規(guī)則卷曲為主要組成部分，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)散布于CsAQP蛋白序列中。

圖1 CsAQP 的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元分布Figure 1 Secondary structure unit distribution of CsAQP

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型由軟件SWISS-MODEL建立。通過SWISS-MODEL對(duì)黃瓜的33條氨基酸序列進(jìn)行同源建模。結(jié)果表明：絕大多數(shù)CsAQP蛋白序列具有十分相似的三維結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)模型如圖2所示，各亞家族內(nèi)成員的相似度較亞家族之間更高。

圖2 CsAQP 家族蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Figure 2 Prediction of tertiary structure of CsAQP family proteins

2.4 CsAQP基因家族的定位分析

由圖3可知：CsAQP基因家族成員映射于1～7號(hào)染色體，其中1號(hào)染色體上僅含CsTIP3;1；2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)染色體各有2個(gè)水通道蛋白家族成員；5號(hào)染色體所含數(shù)量最多，定位到10個(gè)CsAQP基因家族成員；6號(hào)染色體次之，分布9個(gè)CsAQP家族基因。另外，5號(hào)染色體上的CsPIP1;1、CsPIP1;2和CsPIP1;4，6號(hào)染色體上的CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsPIP2;3、CsPIP2;6和CsPIP2;9在各自染色體上形成基因簇，且這些基因之間的同源性較高，推測(cè)其功能相對(duì)保守。

圖3 CsAQP 基因家族成員的染色體位置分布Figure 3 Chromosomal location distribution of CsAQP gene family members

2.5 CsAQP家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

為深入探究黃瓜AQP基因結(jié)構(gòu)功能特征及其氨基酸序列的保守基序，對(duì)其33個(gè)家族成員進(jìn)行內(nèi)含子、外顯子數(shù)目和位置及保守基序進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4A所示：成員外顯子數(shù)目為2～5：NIP亞家族中，除了CsNIP3;1和CsNIP5;1外顯子數(shù)目為4個(gè)之外，其余外顯子數(shù)目均為5個(gè)；PIP亞家族成員含3～4個(gè)外顯子及2～4個(gè)內(nèi)含子；SIP亞家族成員的外顯子與內(nèi)含子數(shù)目均為3個(gè)，表現(xiàn)出高度的一致性；TIP亞家族中，CsTIP1;1和CsTIP1;2的基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)“1個(gè)外顯子+1個(gè)內(nèi)含子+1個(gè)外顯子”的模式，兩者歸屬于同一亞家族的次級(jí)分組，推測(cè)這2個(gè)成員在功能及進(jìn)化上有一定的相似性，其余6個(gè)亞家族成員均含有3個(gè)外顯子；CsXIP1;1的基因結(jié)構(gòu)與CsTIP1;1、CsTIP1;2類似。基因結(jié)構(gòu)在不同亞家族之間存在明顯差異，同一亞家族內(nèi)的差異相對(duì)較小，反映出不同亞家族具有不同功能。

圖4 CsAQP家族成員的基因結(jié)構(gòu)(A)及保守基序預(yù)測(cè)分析(B)Figure 4 Gene structure (A) and conserved motif prediction (B) of CSAQP family members

利用MEME 5.3.3對(duì)CsAQP基因家族進(jìn)行保守基序分析，可視化結(jié)果如圖4B，相關(guān)基序序列如表3。結(jié)果表明：Motif 4的保守序最強(qiáng)；除CsSIP亞族無Motif 1，其余成員均有Motif 1分布。有些Motifs為個(gè)別亞家族所特有，如Motif 3、Motif 5、Motif 10只分布于CsPIP亞族中，Motif 9僅為CsPIP亞族的分組1所特有；Motif 13僅存在于在CsTIP亞族中。上述結(jié)果表明：同一進(jìn)化分支上的成員間保守結(jié)構(gòu)域相似性更高。這些CsAQP基因家族成員間具有相同或特有的Motif，導(dǎo)致了它們之間相似或具備其特有的功能分化。

表3 MEME 程序識(shí)別 CsAQP 相關(guān)基序信息Table 3 MEME program recognizes CSAQP related base sequence information

2.6 CsAQP基因家族共有性序列分析

利用DNAMAN對(duì)黃瓜水通道蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，對(duì)其一致性分析，所有CsAQP成員序列、CsNIP序列、CsPIP序列、CsTIP序列、CsSIP序列一致性分別為35.04%、47.66%、73.38%、58.36%、29.27%。CsAQP蛋白具保守性，且有多個(gè)保守位點(diǎn)，總體而言其序列保留相對(duì)變異性。CsNIP中序列N-端保留變異性，而近C-端具有高度保守性。CsPIP序列的保守頻率高于其他幾個(gè)亞家族。CsTIP序列的N、C兩端均具保守性，但近N-端有部分序列保留變異性。

2.7 CsAQP基因家族順式作用元件分析

為了進(jìn)一步研究CsAQP基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，本研究使用PlantCARE在線工具分析了CsAQP基因家族轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游1 500 bp區(qū)域。鑒定出的元件與激素、光響應(yīng)及抗逆性相關(guān)，大部分CsAQP基因家族含WUN-motif作用元件，且所有成員的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游均含TATA盒以及CAAT-box。其中，BOX 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、ACE、GATA-motif、I-box、AE-box、TCCC-motif、chs-CMA1a、3-AF1 binding site、sp1、Box Ⅱ、CAG-motif、ACA-motif、GA-motif、L-box、MRE(與光反應(yīng)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn))元件功能涉及調(diào)控植物光反應(yīng)；ABRE為脫落酸應(yīng)答元件；MBSI為MYB結(jié)合位點(diǎn)，參與植物體中類黃酮生物的合成；AUXRE(生長(zhǎng)素相關(guān))、AUXRR-CORE(生長(zhǎng)素相關(guān))、TGA-element(生長(zhǎng)素相關(guān))、GARE-motif(赤霉素相關(guān))、P-box(赤霉素相關(guān))、ERE(乙烯應(yīng)答相關(guān))、CGTCA(茉莉酸甲酯相關(guān))、TCA-element(水楊酸反應(yīng)相關(guān))元件功能涉及植物激素調(diào)控；TC-rich repeats(參與防御和應(yīng)激反應(yīng))、LTR(響應(yīng)低溫)、MBS(MYB結(jié)合位點(diǎn)，與干旱相關(guān))、circadian(參與晝夜節(jié)律控制)、MSA-like(參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié))、HD-ZIP Ⅰ(參與柵欄葉肉組織的分化)、CAT-box(與分生組織表達(dá)有關(guān))、motif I(調(diào)節(jié)根特異性)、RY-element(種子特異性調(diào)控相關(guān))元件功能涉及植物的應(yīng)激反應(yīng)以及生長(zhǎng)發(fā)育。

從元件類型來看，光響應(yīng)元件種類最多，于各CsAQP基因啟動(dòng)子區(qū)域均有分布。從單個(gè)元件的具體分布來看，91%家族成員啟動(dòng)子區(qū)分布BOX 4；61%成員啟動(dòng)子區(qū)含ABRE元件。從單個(gè)基因家族成員來看，CsXIP1;1作為新成員，其基因啟動(dòng)子富含激素調(diào)控相關(guān)元件，例如ERE、P-box、TGACG元件，且含與胚乳表達(dá)相關(guān)的GCN4-motif元件；CsNIP2;1、CsNIP5;1、CsNIP6;1、CsNIP7;1、CsPIP1;2、CsPIP1;3、CsPIP2;7、CsPIP2;8、CsSIP1;1、CsTIP3;1 含 1～3 個(gè) TC-rich repeats元件，涉及植物防御及應(yīng)激；CsNIP1;1、CsNIP2;2、CsNIP3;1、CsNIP7;1、CsPIP1;3、CsPIP1;4、CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsPIP2;3、CsPIP2;8、CsPIP2;9、CsTIP1;2、CsTIP1;3、CsTIP2;1基因啟動(dòng)子區(qū)域都含有MBS元件，表明這些基因有可能與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與響應(yīng)干旱脅迫的調(diào)控。CsAQP基因啟動(dòng)子區(qū)的部分元件展示如圖5。

圖5 CsAQP 基因家族成員上游順式元件預(yù)測(cè)Figure 5 Prediction of upstream cis elements of CsAQP gene family members

2.8 CsAQP基因家族串聯(lián)重復(fù)的篩選及其 Ka/Ks分析

已有文獻(xiàn)表明：串聯(lián)重復(fù)偏向于擴(kuò)增膜蛋白功能基因以及與生物和非生物脅迫緊密相關(guān)的基因[17]。為探究黃瓜AQP基因家族在進(jìn)化過程中因串聯(lián)復(fù)制之后基因的偏向性保留和選擇壓力的形式，對(duì)33個(gè)家族成員進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示：黃瓜33個(gè)CsAQP基因家族成員之間，5號(hào)、6號(hào)這2條染色體上共有5對(duì)基因具有串聯(lián)復(fù)制關(guān)系，分別為CsPIP1;2&CsPIP1;1、CsPIP1;2&CsPIP1;4、CsPIP1;1&CsPIP1;4、CsPIP2;6&CsPIP2;3、CsPIP2;2&CsPIP2;3。Ka/Ks分析(表4)發(fā)現(xiàn)：5個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks均小于1，表明這些重復(fù)基因?qū)?jīng)歷純化選擇，消滅群體有害突變，且在進(jìn)化中較為保守，結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，功能具有一致性。

表4 CsAQP基因擴(kuò)增關(guān)系及 Ka/Ks 比率Table 4 Amplification relationship and Ka/Ks ratio of CsAQP gene in Cucumber

2.9 CsAQP 家族成員的互作預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步了解CsAQP成員蛋白的互作關(guān)系，對(duì)33個(gè)成員的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)。結(jié)果如圖6所示：CsPIP1;1、CsPIP1;2、CsPIP1;3、CsPIP1;4、CsTIP2;2均與CsNIP1;1存在互作關(guān)系，且關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。另外，CsSIP2;1與CsTIP、CsPIP、CsNIP亞家族間也有一定的互作關(guān)系。上述結(jié)果表明：部分成員間存在互作關(guān)聯(lián)性，但各成員間的具體網(wǎng)絡(luò)機(jī)制并不清晰，仍需進(jìn)一步研究。

圖6 CsAQP 家族成員蛋白的互作預(yù)測(cè)Figure 6 Prediction of interaction of CsAQP family protein

3 討論

本研究鑒定了黃瓜基因組中的33個(gè)CsAQP基因，CsAQP基因的數(shù)量與水稻及模式植物擬南芥的數(shù)量相似。這表明CsAQP基因在植物中有形成多基因家族的可能。基因進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力來源于基因擴(kuò)增，而串聯(lián)復(fù)制是基因擴(kuò)增的方式之一。有研究表明：響應(yīng)多種逆境脅迫的基因擴(kuò)增與串聯(lián)復(fù)制密切相關(guān)[17]。這類基因通常是劑量不敏感基因或位于代謝途徑兩端。方璐等[18]在白菜Brassica rapa中研究發(fā)現(xiàn)：與膜蛋白功能相關(guān)以及抗逆相關(guān)、新陳代謝相關(guān)的基因都發(fā)生了串聯(lián)復(fù)制，這些相關(guān)基因在誘導(dǎo)防御反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)：在黃瓜5號(hào)和6號(hào)染色體中共發(fā)現(xiàn)5對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，這表明串聯(lián)復(fù)制參與黃瓜CsAQP基因的擴(kuò)增。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：CsAQP基因可以清晰地分為5個(gè)亞家族，相對(duì)于擬南芥、水稻，多1個(gè)新成員(CsXIP1;1)。有研究表明：植物中XIPs序列的分析及其功能方面的鑒定有助于更好地探究AQPs進(jìn)化過程的分類[19]。同時(shí)，外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的分析也有益于探究植物基因家族內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系[20]。從預(yù)測(cè)結(jié)果中可以看出：基因間結(jié)構(gòu)差別明顯，但聚類較近的CsAQP基因其結(jié)構(gòu)存在相似。CsNIP亞家族含有的外顯子數(shù)量相對(duì)多于其他4個(gè)亞家族，這與JOHANSON等[21]在擬南芥上的發(fā)現(xiàn)一致。基因家族成員在編碼氨基酸數(shù)量、分子量、理論等電點(diǎn)等生理生化性質(zhì)也隨CsAQP基因編碼序列的長(zhǎng)短及堿基比例的不同而表現(xiàn)出一定差異。

MEME (multiple EM for motif elicitation)分析發(fā)現(xiàn)：基序組成總體保守，例如所有的CsAQP基因都有一個(gè)共同的保守基序(KAWDDHWIYWVGPFIGAAJAALYYQFILR)，但不同的亞家族之間也有其獨(dú)特的保守基序，這為CsAQP基因家族的細(xì)分提供一定的依據(jù)。分別以限值10、15、20為條件，再次預(yù)測(cè)CsAQP基因家族的保守基序，在幾個(gè)重復(fù)對(duì)之間均能發(fā)現(xiàn)某些Motif的得失，與ZHOU等[22]在ClDof基因家族所得出的結(jié)論相似。初步分析這些Motif可能與CsAQP基因的功能分化相關(guān)。此外，CsAQP基因家族成員基因啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件種類豐富，包括黃瓜抗逆相關(guān)的元件以及黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的作用元件，如所有CsAQP基因家族成員基因啟動(dòng)子區(qū)都含有多種與光響應(yīng)相關(guān)的元件。因此，這33個(gè)基因可能參與黃瓜光反應(yīng)調(diào)控。CsPIP1;2、CsNIP2;2、CsNIP3;1、CsTIP2;1、CsTIP3;1中含有HD-ZIP I元件，可能參與葉肉組織分化。

水通道蛋白在低等植物和高等植物中均有所研究[23]，其中高等植物水通道蛋白研究相對(duì)較多。擬南芥作為模式植物，其AQP在低溫、干旱等逆境下的相關(guān)研究已被陸續(xù)報(bào)道。許多植物AQP成員間的互作關(guān)聯(lián)性也得到了驗(yàn)證，如番茄[24]、水稻和玉米[25]。與這些植物AQP相比，CsAQP基因功能的研究相對(duì)緩慢但卻取得了一定進(jìn)展。已有研究顯示：CsAQP在脅迫反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。陳露倩等[26]研究發(fā)現(xiàn)：CsPIP2;4于干旱脅迫處理下，其表達(dá)量在脅迫后2 h達(dá)到相對(duì)最高值，而隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CsPIP2;4表達(dá)豐度顯著下降。然而，目前對(duì)CsAQP基因的具體作用機(jī)制了解尚淺，尤其是不清楚CsAQP基因?qū)Ψ巧锩{迫的調(diào)控機(jī)制。本研究通過對(duì)CsAQP基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、保守基序、亞細(xì)胞定位與系統(tǒng)進(jìn)化樹等分析，將有助于鑒定其生物學(xué)功能，為進(jìn)一步探究其功能特性提供了一定的理論依據(jù)。此外，對(duì)于CsAQP基因在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及與各種環(huán)境脅迫因子的關(guān)聯(lián)性也有待探索。