揮發性有機化合物檢測在食管-胃腸惡性腫瘤篩查中的研究進展

張 兵，王宏志，儲焰南，陸 燕，葛殿龍，劉 玥

隨著醫療技術水平的提高，世界范圍內預期壽命增加，癌癥逐漸發展成為威脅人類壽命的重要疾病之一，并將成為未來家庭的主要經濟負擔之一[1]。在所有腫瘤患者中，消化道腫瘤占所有癌癥發生率的50%[2]。消化道腫瘤中，早期食管癌、胃癌及結直腸癌患者通常無明顯癥狀，因此普通體檢很難及時發現，而等到患者出現相關癥狀時，多處于疾病晚期，喪失手術機會，預后不佳。根據全球癌癥狀況最新的統計數據(GLOBOCAN 2020)顯示[3]：食管癌、胃癌和結直腸癌分別占癌癥相關死亡的第六、第四和第二位。在2020年，全球新增食管癌、胃癌和結直腸癌的病例分別為60.4萬、100萬和190萬，因這些疾病死亡的病例分別為54.4萬、76.9萬和93.5萬。目前食管癌、胃癌及結直腸癌的早期篩查主要依賴胃腸鏡檢查，但由于胃腸鏡檢查的體驗感差，并且具有一定的創傷性和風險性，因此臨床普及率遠低于醫學影像檢查。

人類呼出氣體中存在250余種揮發性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)，它們的濃度大多在皮摩爾(10～12 mol/L)到納摩爾(10～9 mol/L)水平[4]。Broza指出某些病理情況下，尤其對惡性腫瘤患者，其體內生成的VOCs會發生改變[5]。這主要是因為腫瘤相關的炎癥導致氧化應激增強，葡萄糖代謝改變，癌細胞氧化還原調節可導致癌癥患者發生不同的VOCs信號改變[6-7]，利用靈敏度極高的儀器對消化道腫瘤患者呼出的VOCs進行檢測，有可能識別出癌癥患者特有的“呼氣特征”。本文綜述了近年來利用揮發性有機化合物(VOCs)鑒定食管癌、胃癌及結直腸癌的研究進展，以檢驗VOCs分析的診斷性能，這可能在臨床實踐中有應用價值。

1 揮發性有機化合物概述

世界衛生組織對VOCs的定義為：室溫下飽和蒸氣壓超過133.32Pa，沸點在50～260℃，常溫下以蒸汽形式存在于空氣中的一類有機物。是除CO、CO2、H2CO3、金屬碳化物、金屬碳酸鹽、碳酸銨外，任何參與大氣光化學反應的含碳化合物[8]。既往的研究認為，VOCs廣泛存在于室外大氣及室內空氣中[9]。人體呼氣中也含有多種VOCs，根據來源可將其分為外源性和內源性化合物。外源性VOCs來源于環境因素，如食物和飲料的消費、吸煙或其他環境暴露。內源性VOCs是人體或微生物代謝的副產品或最終產物。因此，對腫瘤患者體內VOCs的檢測，重點研究對象是內源性VOCs，重點排除對象是外源性VOCs。人體VOCs可以在汗液、血液、病理組織、尿液和糞便中檢測到[10-12]，但呼氣VOCs是目前研究內容較多的部分。

與傳統的血液、尿液及其他生物樣品比較，呼氣VOCs檢測具有下述優點：①樣品采集為無損傷、非侵入式，不給受檢者帶來任何痛苦體驗，感染傳染性疾病的風險較??；②呼氣取樣方便，可重復多次采樣及進行大規模的高通量篩查；③呼氣中的VOCs基質成分相對簡單，分析便捷；④可提供揮發性代謝物信息，是血樣及尿樣代謝物的重要補充。正是由于上述優點，呼氣VOCs檢測廣泛應用于各種疾病的臨床研究。如Koureas[13]篩選出22種VOCs，可識別肺癌患者，靈敏度為100%，特異度為81.3%。Esfahani等[14]發現2型糖尿病患者呼氣中丙酮濃度顯著高于健康人群，并根據5位健康人呼氣中丙酮濃度較高，判斷出其有患病風險。VOCs是人體代謝過程中的一項產物，其在呼出氣體中的存在形式，很大程度上取決于患者當時的代謝狀態。呼氣成分的改變不僅可以由癌癥引起，還可以由其他潛在的內源性和外源性影響因素引起，如禁食狀態、微生物群、吸煙、飲酒、藥物、各種并發疾病以及暴露于不同環境的空氣污染等，當設計呼氣分析的診斷研究方案時，所有這些問題都應被考慮進去[15]。

2 揮發性有機化合物檢測方法

目前最常用的VOCs檢測技術有氣相色譜質譜(GC-MS)、質子轉移反應質譜(PTR-MS)和選擇離子流動管質譜(SIFT-MS)等。

氣相色譜質譜分析(GC-MS)是綜合了氣相色譜法對有機化合物有效分離、分辨能力與質譜法準確鑒定化合物的聯合技術，可在計算機操控下，直接用氣相色譜分離復雜混合物樣品，使化合物逐個進入質譜儀的離子源，以電子轟擊，或化學離子化等方法，使每個樣品中所有的化合物均離子化。GC/MS結合樣品采集和富集技術，特別是固相微萃取技術(SPME)，進一步加強了混合樣品中VOCs的分離和鑒定[16]。目前利用GC-MS技術可分析出人體的VOCs主要包括：烴類、醇類、醛酮類、芳香族類、羧酸類、胺類、硫醚、鹵代化合物等[17]。

PTR-MS為基于初級離子與待測化合物發生質子轉移反應的直接質譜分析技術[18]。水蒸氣在離子化區域經空心陰極放電或放射源產生初級離子H3O+，引入的連續樣品氣流在漂移管中與H3O+混合，發生質子轉移反應產生樣品特征離子，從而被下游的質量檢測器檢測到。PTR-MS具有快速篩查癌癥的潛力。它還具有極高的靈敏度，也可頻繁快速檢測[19]。但由于PTR-MS僅可提供待測物的特征質荷比m/z信息，無法選擇不同的初級離子來分辨具有相同分子量的化合物，故PTR-MS適用于人體呼出氣目標分析，對于不明確的物質或非目標物分析，還需結合其他分析手段進行定性。

離子流動管質譜(SIFT-MS)選擇的前驅離子在微波放電源中形成，通過質量過濾器根據其質荷比m/z選擇前驅離子，注入流動的氦載氣中，它們在流動管中形成熱群對流[15]。離子群/載氣的流速決定了反應時間。通過對下游光譜儀/檢測系統前驅體離子和特征產物離子計數率的測量，實現了痕量和揮發性化合物的十億分之一體積(ppbv)或百萬分之一體積(ppmv)的絕對濃度測量[20]。

3 揮發性有機化合物在食管癌篩查中的應用

食管癌是一種包含腺癌、鱗癌和小細胞癌的三種亞型且致死率高的癌種。全球范圍內食管癌的發病率呈上升趨勢，這與其相關致病因素增加有關。大多數食管癌患者早期無明顯臨床癥狀，導致診斷時已處于疾病晚期，5年生存率不足15%。目前臨床早期診斷食管癌多依賴于胃鏡病理學活檢。但胃鏡檢查為有創性，且舒適性差，這成為許多患者放棄體檢的主要原因。在與食管癌相關的血清腫瘤標志物方面，有學者利用meta分析回顧了抗p53、癌胚抗原、鱗狀細胞癌抗原、細胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)、血管內皮生長因子-c和mi‐croRNA(miRNA)6種血清生化標志物，盡管每項標志物都與食管癌陽性優勢比相關，但每種檢測的靈敏度及特異度均較低[21]。因此，需要尋找舒適性更好、更便捷的診斷方法，以便能夠篩查出處于早期階段的食管癌患者。

呼氣分析是早期發現癌癥的一種比較有吸引力方法，與傳統內鏡檢查相比，呼氣分析完全是無創的、相對便宜的，并且在樣本收集后能夠快速提供檢測結果。目前已有文獻指出，該方法已經在肺癌臨床檢測中得到應用[22]。在食管癌檢測方面，英國帝國理工學院、國立衛生研究院的Sheraz Markar[23]開展了一項多中心盲法驗證性研究，共納入Ⅰ～Ⅲ期食管癌患者163例，對照組患者172例，對兩組分別進行呼氣檢測，并通過矢量分析法得到5種揮發性有機物（丁酸、戊酸、己酸、正丁醛、癸醛），除戊酸外的其他4種揮發性有機物都與食管癌患者的人口學因素顯著相關，檢測靈敏度和特異度分別為84%和88%，操作者特征曲線面積(AUC)為0.90±0.02。而庫馬爾等[24]在《食管癌和胃腺癌中揮發性有機化合物生物標志物的質譜分析》中檢測得出食管癌組患者呼出氣體中的苯酚含量較非癌對照組高(P<0.001)。

Zou等[25]應用中科院合肥研究院醫用質譜團隊自制的質子轉移反應質譜儀(PTR-MS)，檢測了29例食管癌患者和57例健康人的呼氣VOCs。應用Mann-Whitney U檢驗和逐步判別分析來識別呼氣質譜數據中的離子，同時還對受試者的呼氣結果進行了工作特征曲線(ROC)分析。結果顯示，呼氣質譜中的7種離子，即m/z 136、m/z 34、m/z 63、m/z 27、m/z 95、m/z 107和m/z 45，被認為可能是食管癌患者的特征性離子，因為其區分食管癌患者和健康人的真陽性率為86.2%，真陰性率為89.5%。與健康人相比，食管癌患者呼氣質譜顯示5種離子的中值強度降低，其余2種離子強度升高。ROC分析得出的曲線下面積(AUC)為0.943。說明PTR-MS檢測到的呼氣中VOCs的離子特性在用于區分食管癌患者和健康人組中有較大意義。隨著VOCs檢測技術靈敏度的提高，呼氣分析作為一種完全非侵入性的癌癥檢測新方法，初步顯示出良好的臨床應用前景。但是，也要正視到目前大多數的臨床研究都是概念性研究，并且這些研究多是在小群體中進行的，還使用了不同的檢測分析技術，總體標準化程度不高，這些因素共同制約了VOCs檢測技術的臨床實用性能。

4 揮發性有機化合物在胃癌篩查中的應用

胃癌是僅次于結直腸癌的常見消化道惡性腫瘤，其診斷晚、病死率高，已經成為威脅人類生命健康的一大重要癌種。統計數據顯示，胃癌占癌癥死亡相關原因的第四位[3]。胃癌的臨床診斷多依賴于內鏡篩查，但這項檢查手段對患者具有侵入性，經濟成本也較高，在臨床推廣中遇到很大困難。傳統胃癌腫瘤標志物檢測方法，如糞便隱血、癌胚抗原、CA-19-9、CA125等，由于診斷特異度差、靈敏度低，其診斷效果較胃鏡檢查尚有差距[26]。VOCs作為一種新的、非侵入性的生物學腫瘤標志物檢測方法，在早期胃癌無創篩查中有較好的應用前景[27]。常用的揮發性內源性化合物，其作為潛在的生物標志物包括：碳氫化合物(乙烷、戊烷和異戊二烯)、含氧化合物(丙酮、乙醛、甲醇、乙醇和2丙醇)[19]、含硫化合物(二甲基硫化物、甲基硫醇、乙基硫醇、以及二硫化碳)和含氮化合物(氨、二甲胺和三甲胺)[28-29]。烷烴、酮類和醛類是通過脂肪酸的氧化在人體內形成的。丙酮是在碳水化合物代謝和脂質過氧化過程中形成的[30]。在炎癥和氧化應激時，它們的濃度會增加，這通常伴隨著癌癥的發生。

Bel'skaya等[31]探討了含氧唾液VOCs在胃癌及結直腸癌中的潛在診斷能力，以毛細管氣相色譜法對11例胃癌、19例結腸癌、16例健康志愿者的唾液標本進行了分析，檢測了樣本的脂質過氧化物水平及過氧化氫酶活性。結果表明，唾液VOCs(乙醛、丙酮、丙醇-2及乙醇)可區分癌癥與健康者，靈敏度及特異度分別為95.7%、90.9%。甲醇水平可用于明確腫瘤部位，檢測胃癌及結直腸癌的靈敏度分別為80.0%、92.3%，特異度均為100%。說明唾液VOCs可用于診斷胃癌及結直腸癌。

Ligor等[32]檢測了呼氣及胃組織樣本中的VOCs以診斷癌癥。該研究從3例胃癌患者中收集了患者的呼氣及癌組織樣本，在呼氣及組織樣本中鑒定出丙酮、二硫化碳、2-丙醇、乙醇、乙酸乙酯，這些化合物為內源性VOCs。計算二硫化碳、2-丙醇及正丁烷的丙酮比(AR)，發現正常組織的二硫化碳的AR高于癌組織。該研究方法的精密度RSD低于11%，線性范圍為2.8～136 ppb，檢測范圍為0.6～2.1 ppb。說明VOCs可用于區分正常組織與癌組織，在胃癌的診斷中具有一定的應用價值。

Kumar[33]等采用SIFT-MS技術聯合內鏡病理檢查，對10例胃癌患者的胃內容物樣本進行VOCs檢測，每個樣本重復檢測三次，并與健康者的胃內容物樣本VOCs檢測結果進行比對分析，最終得出7種(丙酮、甲醛、乙醛、己酸、硫化氫、氰化氫和甲基苯酚)有統計學意義的VOCs。由此認為胃內容物可能是一種對胃癌診斷有一定指導意義的生物樣品，同時也能提高對上消化道疾病發病機制的認識。通過對胃內容物VOCs檢測分析，我們推測可以鑒別出與胃癌相關的揮發性有機物，這可能有助于臨床開發出新的診斷方法。

5 揮發性有機化合物在結直腸癌篩查中的應用

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)為世界范圍內第三大常見腫瘤，居腫瘤相關死亡原因的第二位[3]。多數患者就診時已處于疾病晚期，總體生存期明顯低于其他癌種。結直腸腫瘤通常由結腸息肉病變發展而來，其中涉及到遺傳學、組織學和形態學變化，因此腸鏡檢查是目前臨床上篩查結直腸癌應用最廣泛且最有效的方法，可顯著降低CRC的發病率和病死率[34]。同樣，結直腸鏡檢查過程中也存在一些并發癥和危險因素：如進鏡時可能引起肛門疼痛、腸黏膜損傷、腸道出血、穿孔，以及因內鏡消毒不合格引起交叉感染等風險，目前臨床推廣存在困難。

揮發性有機化合物（VOCs）檢測在結直腸癌篩查中有一定應用前景，Amann等[35]指出與腸道疾病有密切關聯的糞便VOCs檢測總量為381種，約為呼吸中揮發性物質的一半。但由于從受檢者中獲得糞便樣本相對困難和腸道清洗等對腸道內微生物種群的影響，目前大規模的糞便VOCs檢測分析研究較少。目前利用唾液VOCs來輔助診斷結直腸癌的研究較多。原因在于唾液在收集、儲存、輸送、采樣和處理方面有許多優勢。血液在毛細血管中的溶解性物質，可以快速通過唾液腺薄膜，從而形成唾液內物質含量與血液內物質含量相近或相似，因此在反映身體生理狀態方面，唾液檢測被認為在功能上接近于血液檢測。此外，唾液的組成與血液和尿液中化學物質的含量密切相關，如甲醇，2-丙醇和乙醇。乙醇和乙醛由人體內源性形成[36]。乙醛的形成與酶酒精脫氫酶(ADH)和細胞色素p450的活動有關。無論這種機制如何，唾液和粘膜中的乙醛水平升高在致癌中起著重要作用。唾液中發現了一些消化道腫瘤的揮發性生物標志物。例如有文獻[37]介紹了通過色度-晶體5000色譜儀上的毛細管氣相色譜法檢測胃癌(n=11)、結腸直腸癌(n=18)和健康對照組(n=16)唾液中的VOCs，研究結果顯示，唾液中的乙醛、甲醇和乙醇在胃癌患者中含量較高，而結腸直腸癌患者唾液中丙酮含量較高。與健康對照組相比，結腸直腸癌患者唾液中1-丙醇和2-丙醇含量減少。最終這些物質用于檢測胃癌和結腸直腸癌的靈敏度分別為80.0%和92.3%。

在呼氣檢測方面，氣體VOCs也顯示出了一些，如Altomare等[38]最近使用GC-MS對37例結直腸癌患者和41例健康對照組呼出的氣體中VOCs進行了對比分析，共得出58種VOCs被認為與結直腸癌有一點關聯，對結直腸癌識別能力>90%的VOCs包括癸醛、1,2-戊二烯、環己烷、甲基環己烷和1,3-二甲苯。在血液檢測方面，Wang[39]等對16例結直腸癌(CRC)患者的血液VOCs檢測研究顯示，與健康對照組相比，其血液代謝生物標志物發生了變化。CRC患者的苯基甲基氨基甲酸酯、乙基己醇和6-t-丁基-2,2,9,9-四甲基-3-5-癸二烯-7-炔水平較低，而1,1,4,4-四甲基-2,5-環己烷-二甲基水平較高。血液VOCs分析在CRC患者中具有臨床應用價值。

6 總結

我國揮發性有機化合物檢測在臨床中應用尚處于起步階段，與傳統的侵襲性診斷操作和血清學腫瘤標志物相比，揮發性有機化合物檢測具有無創，診斷靈敏度高、特異度好等優勢，VOCs在疾病早期篩查中具有無與倫比的優勢?，F有的設備已具備分析VOCs的能力，通過使用VOCs分析來檢測疾病和評估接觸揮發性有機化合物/氣體的情況，仍有許多挑戰需要克服，包括標準化、取樣方法和確定標記等。相信在不久的將來，隨著色譜、質譜技術的廣泛應用，VOCs在食管癌、胃癌及結直腸癌早期篩查中必將發揮重要的作用。