銅綠假單胞菌碳青霉烯類抗生素耐藥機制研究

摘要：目的 探究杭州某醫院銅綠假單胞菌的耐藥機制。方法 采用紙片擴散法對耐藥菌株進行篩選;抗生素的最低抑菌濃度（MIC）用瓊脂稀釋法檢測;PCR擴增碳青霉烯酶基因（blaKPC-2、blaMCR-1、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2）;用MLST對銅綠假單胞菌進行ST分型。結果 78株對亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌中發現24株含KPC-2型碳青霉烯酶，MLST結果顯示，21株（87.5%）為ST463，2株（8.3%）為ST1076，1株（4.2%）為ST244。結論 KPC-2酶已成為杭州某醫院銅綠假單胞菌碳青霉烯類抗生素耐藥重要原因之一，ST463是該院產KPC-2酶銅綠假單胞菌主要ST型別。

關鍵詞：碳青霉烯酶;銅綠假單胞菌;KPC-2

【中圖分類號】R453.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）08-019-02

上世紀70年代后期研發出的碳青霉烯類抗生素是該時期抗菌譜最廣、抗菌活性最強的非典型β-內酰胺類抗生素，被認為是抗生素的最后一道防線[1]。碳青霉烯類抗生素主要通過抑制青霉素結合蛋白從而抑制參與細菌細胞壁黏肽合成的內肽酶和糖苷酶的合成，使細菌的細胞壁破損，致細菌膨脹、溶解、失活，從而達到滅菌效果。近年來，由于臨床廣譜抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌（PAE）對各類抗生素的耐藥性均逐年升高，對醫院的院內感染防控和臨床的抗感染治療造成巨大的挑戰。

目前，人們發現CRPA的耐藥機制主要有：（1）主動外排系統過表達;（2）產生碳青霉烯水解酶;（3）外膜蛋白OprD2的缺失或突變等。除上述耐藥機制外，銅綠假單胞菌新的耐藥機制還在不斷地產生。如2013年，中國在世界上首次報道從泛耐藥銅綠假單胞菌中查出KPC型β-內酰胺酶基因[2]。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）主要存在于腸桿菌科細菌內，是近些年來人們重點關注的碳青霉烯酶之一，其不僅可以水解所有β-內酰胺類抗生素，包括碳青霉烯類抗生素，而且阿莫西林/克拉維酸（AMC）也不能完全將其滅活[3]。

在PAE對碳青霉烯類抗生素耐藥機制的研究中，關于KPC等非金屬酶的報道相對于金屬酶型碳青霉烯酶，目前依然較少，但種種報道表明這些非金屬酶導致的耐藥機制在逐漸由腸桿菌往非發酵菌擴散 [2、4]。此次研究對從該醫院住院患者標本中分離出的78株CRPA進行研究，發現KPC-2已經成為該院銅綠假單胞菌流行較廣的碳青霉烯酶之一，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 從2018年7月至2019年7月杭州某醫院兩院區住院患者的各類標本中分離出78株對碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌，采用全自動微生物鑒定儀（Vitek 2 Compact）鑒定細菌到種。K-B紙片法驗證菌株對碳青霉烯類抗生素的敏感性。

1.2 主要儀器和試劑 主要儀器設備：全自動微生物鑒定儀Vitek-2 Compact、比濁儀Vitek Densichek（法國BioMérieux公司）;PCR擴增儀（德國Biometra公司）;VITEK MS質譜鑒定系統（法國生物梅里埃公司）;Powerpac基礎電泳儀（美國BIO-RAD公司）。主要試劑：M-H瓊脂干粉、哥倫比亞基礎瓊脂干粉（英國Oxoid公司）;中國藍玫瑰酸瓊脂（杭州天和微生物試劑有限公司）;VITEK GP和GN鑒定卡（法國BioMérieux公司）;核酸電泳瓊脂糖（西班牙Biowest公司）;VITEK MS配套試劑：α-氰4-羥基苯丙烯酸（HCCA）、三氟乙酸（TFA）、無水乙醇、甲酸、色譜純乙腈（美國Sigma公司）;PCR反應試劑盒、DNA Marker DL20，00、DL5，000、DL15，000（日本Takara公司）。

1.3 細菌的鑒定 用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定儀和VITEK MS質譜鑒定系統對住院患者中分離的CRPA進行重新鑒定。（參照相應儀器的說明進行Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定儀和VITEK MS的操作）

1.4 PCR擴增耐藥基因和序列分析 PCR擴增碳青霉烯酶基因（blaKPC-2、blaMCR-1、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2）。耐藥基因引物相關信息見表1。用堿裂解法提取細菌質粒DNA作為模板。PCR反應體系：5μl 10×Buffer 緩沖液，3μl dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，3μl DNA模板，上下游引物各1μl，用無菌純水補足到50μl。PCR反應條件：94℃預變性5min，1個循環;94℃變性1min，退火1min（退火溫度根據不同引物而定），72℃延伸1min，35個循環;72℃延伸7min，1個循環。用1%瓊脂糖凝膠對耐藥基因進行恒壓電泳，電壓：100V，時間：25min，最后在紫外燈下觀察結果。

1.5 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST） PCR擴增銅綠假單胞菌7對管家基因（acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE）。引物序列、TM、擴增長度見表2。具體操作方法：提取細菌基因組DNA作為模板，PCR反應體系：5μl 10×Buffer 緩沖液，3μl dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，3μl DNA模板，上下游引物各1μl，用無菌純水補足到50μl。PCR反應條件同上，紫外燈下觀察結果。將獲得的PCR產物純化后送上海生工公司測序，將序列結果提交到數據庫https：//pubmlst.org/paeruginosa/info/primers.shtml進行在線序列比對，最終確定菌株的MLST型別。

2 結果

2.1 菌株收集情況 2018年7月至2019年7月，從該醫院兩院區住院患者標本中分離得到碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌78株，其中69株分離自老院區，9株分離自新院區。其中65.4%（51/78）的菌株分離自ICU病房。痰液是此次研究中耐藥菌株的主要來源，60.3%（47/78）菌株來自痰液，19.2%（15/78）菌株來自尿液，20.5%（16/78）菌株來自其他標本（糞便、膿液、膽汁、全血等）。

2.2 菌株耐藥基因檢測情況 通過耐藥基因檢測，78株碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌中有24株為KPC-2陽性（表3）。

2.3 藥物敏感性試驗 采用瓊脂稀釋法檢測24株KPC-2陽性銅綠假單胞菌對臨床上常用的頭孢類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等抗生素的藥物敏感性，根據銅綠假單胞菌藥敏試驗解釋標準判斷菌株的藥物敏感性。檢測結果為：24株菌株全部都對碳青霉烯類藥物耐藥，多數菌株（≥75%）對頭孢類抗生素（頭孢曲松，頭孢吡肟）、氨曲南、替加環素耐藥;少數菌株（≤25%）對氨基糖苷類（慶大霉素，阿米卡星，妥布霉素）耐藥;另有70.8%（17/24）菌株對左旋氧氟沙星耐藥，62.5%（15/24）對環丙沙星耐藥。

2.4 多位點序列分析 利用已知的7對管家基因對24株CRPA進行多位點序列分型，分型結果見表4。ST463為主要分型，高達87.5%，只有個別菌株為ST1076和ST244型。

3.分析和討論

銅綠假單胞菌是醫院感染的主要病菌之一，免疫力低下的患者常常容易被感染。并且多重耐藥菌株的陽性率也呈逐年上升的趨勢，在該醫院也形成了廣泛的流行，甚至出現了泛耐藥菌株，其對碳青霉烯類、氨基糖苷類、頭孢類和氟喹諾酮類等臨床常用抗生素均耐藥，這給醫院的臨床治療帶來極大挑戰[5]。

近些年來，對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的PAE在全球范圍內大流行，國外對耐藥菌株的報道也日益增多[6]。研究發現銅綠假單胞菌中碳青霉烯酶類型大不相同，據國外報道顯示，其銅綠假單胞菌所產的碳青霉烯酶主要以VIM為主，且有多種亞型，另外IMP型也較多見[7、8]。而本次對該醫院的78株銅綠假單胞菌耐藥基因的檢測顯示30.8%（24/78）的菌株為KPC-2型，未見VIM和IMP型耐藥菌株。

在世界范圍內，銅綠假單胞菌的多位點序列分型（MLST）較多的是ST235，ST244，ST357等[9]。德國有過報道產KPC-2的銅綠假單胞菌為ST235[10]，且ST235曾在世紀范圍大流行，西班牙、韓國等地都有過爆發[11-12]。另外2018年在巴西發現了新的產KPC-2銅綠假單胞菌分型：ST2584[13]。而本次實驗的24株KPC-2陽性銅綠假單胞菌菌株的多位點序列分型結果顯示ST463型菌株高達87.5%，為主要分型，不同于其他國家，提示國內流行有其特異性。

2007年杭州的浙一醫院首次報道了我國產KPC-2酶肺炎克雷伯菌[14]，隨后在2011國內出現首例產KPC-2酶銅綠假單胞菌[15]。2015年有研究證實肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌攜帶的KPC-2型碳青霉烯酶的編碼基因位于質粒上，并確定碳青霉烯類抗生素的耐藥性能夠伴同質粒在不同菌種間傳播[16]。結合本次實驗數據，高達87.5%的ST463型菌株攜帶者多為ICU病房住院患者，提示克隆傳播的可能性極大，這對住院患者的臨床治療帶來巨大的挑戰，且必須對產KPC-2銅綠假單胞菌株加以預防和控制，防止其進一步流行播散。

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作者簡介：何勝兵（1997-04）男，漢族，安徽省滁州市，杭州市兒童醫院，技師，本科，理學學士學位，細菌耐藥性