隱丹參酮對肺鱗癌KAL△LU細胞增殖和周期以及干細胞抗原1的影響

李錚 侯煒

目前，肺癌仍然是全球范圍內引起癌癥相關死亡的主要病因，其中非小細胞肺癌約占所有肺癌的85%[1]，肺鱗癌是非小細胞肺癌常見的病理類型之一。大多數患者確診肺鱗癌時已為中晚期，5年生存率低于15%[2]。對于晚期肺鱗癌，含鉑雙藥化療仍然是首選方案[3]。盡管靶向治療和免疫治療迅速發展，只有少部分肺鱗癌患者從治療中獲益[4]。因此積極尋找有效且毒副作用小的藥物及療法仍是研究方向之一。隱丹參酮(cryptotanshinone，CPT)是從中藥丹參根及根莖部位提取的脂溶性化合物，在體外能抑制肺、肝、乳腺、胃癌等多種腫瘤細胞增殖[5-8]。但關于隱丹參酮干預肺鱗癌的報道并不多見。本研究用隱丹參酮干預肺鱗癌KAL△LU細胞，觀察其對增殖、凋亡、周期以及干性標志物干細胞抗原1(stem cell antigen,Sca-1)的影響，探討隱丹參酮對肺鱗癌KAL△LU細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

KAL△LU細胞株由美國國立癌癥研究所Dr.Yinling Hu實驗室提供。

1.2 主要試劑和儀器

隱丹參酮(貨號：S2285)購自于selleck公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(貨號：D2650)、四甲基偶氮唑藍(measurement of trititaed thymidine incorporation，MTT)(貨號：M2128)購自于Sigma公司；流式凋亡試劑盒(貨號：559763)、PI/RNase染色緩沖液(貨號：550825)、Sca-1-FITC抗體(貨號：562058)購自BD公司。CO2培養箱、多功能全波長酶標儀購自于Thermo公司；流式細胞儀購自于BD公司。以上試劑和儀器由美國國立癌癥研究所Dr.Yinling Hu實驗室提供。

1.3 細胞培養

復蘇KAL△LU細胞，以1×106接種于100 mm培養皿中，加含10%胎牛血清、1%青霉素(1萬單位/mL)、鏈霉素(10000 μg/mL)的RPMI-1640培養基10 mL，5% CO2、37℃培養箱培養，2～3天換液1次，用含0.25% 乙二胺四乙酸的胰酶消化后取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.4 細胞MTT檢測

取對數生長期KAL△LU細胞，消化計數后分成對照組(DMSO組)與隱丹參酮組(DMSO+隱丹參酮組)，同時設空白組。兩組設不同濃度，每個濃度設3個復孔，每孔接種5×103KAL△LU細胞，待細胞貼壁后，分別加入DMSO與DMSO+隱丹參酮并調整隱丹參酮終濃度為6.25、12.5、25、50 μM。加藥24、48、72小時后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養箱孵育4小時，加入150 μL的DMSO，1000 r/min震蕩10分鐘，使用酶標儀490 nm波長讀取OD值。細胞存活率(%)=[(隱丹參酮組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。實驗重復一次。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡、周期和Sca-1

取對數生長期細胞，以1×106接種于100 mm培養皿，待細胞貼壁后，分別加DMSO與DMSO+隱丹參酮，根據MTT實驗結果，CPT干預KAL△LU細胞的半數抑制濃度約為25 μM，因此調整隱丹參酮終濃度為25 μM，培養24、48、72小時后收集細胞上清液至15 mL離心管，培養皿內加胰酶消化細胞，加入適量培養基終止消化，收集細胞及培養基至相同離心管，300 g離心5分鐘，棄上清，用冷的PBS洗兩遍。細胞凋亡：用1×結合緩沖液重懸細胞(>1×106/mL)，取100 μL至流式管，加5 μL的Annexin V 和 2 μL的7-AAD，室溫避光孵育15分鐘，加400 μL的1×結合緩沖液，1小時內上機檢測。細胞周期：用1 mL的PI/RNase 染色緩沖液重懸細胞，室溫孵育30分鐘，轉移至流式管，上機檢測。Sca-1：加入1 mL 流式緩沖液，調整濃度為1×106/mL，取100 μL，加入 1 μL的Sca-1-FITC，室溫避光孵育30分鐘，300 g離心5分鐘，重懸于100 μL流式緩沖液中，加200 μL多聚甲醛固定，上機檢測。實驗重復一次。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度隱丹參酮對KAL△LU細胞增殖的影響

隱丹參酮干預KAL△LU細胞后，在12.5、25、50 μM濃度時可以抑制細胞增殖，且隨時間與濃度增加，抑制作用增強。12.5 μM 隱丹參酮干預24、48、72小時后細胞存活率降低(P<0.05)，25 μM、50 μM隱丹參酮干預24、48、72小時后細胞存活率明顯降低(P<0.01)，而6.25 μM隱丹參酮干預后細胞存活率無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 不同濃度隱丹參酮24、48、72小時KAL△LU細胞存活率比較

2.2 細胞凋亡檢測

25 μM隱丹參酮干預KAL△LU細胞24、48、72小時后， 流式細胞術檢測KAL△LU細胞凋亡情況， 結果顯示，對照組與隱丹參酮組早期凋亡率比較無明顯統計學差異(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 25 μM隱丹參酮干預KAL△LU 24、48、72小時細胞凋亡散點圖

表2 25 μM隱丹參酮干預KAL△LU24、48、72小時細胞凋亡率比較

2.3 細胞周期檢測

25 μM隱丹參酮干預KAL△LU細胞，流式細胞術檢測細胞周期。結果顯示，干預24小時后，對照組與隱丹參酮組細胞周期各期均無明顯統計學差異(P>0.05)；干預48小時后，與對照組相比，隱丹參酮組G0/G1期比例降低，S期比例增加，具有統計學差異(P<0.05)； 干預72小時后，與對照組相比，隱丹參酮組G0/G1期比例降低，S期比例增加，具有明顯統計學差異(P<0.01)。見表3、圖2。

圖2 25 μM隱丹參酮干預KAL△LU 24、48、72 小時細胞周期圖

表3 25 μM隱丹參酮干預KAL△LU24、48、72小時細胞周期比較

2.4 細胞干性標志物 Sca-1檢測

25 μM隱丹參酮干預KAL△LU細胞24、48、72 h后，流式細胞術檢測Sca-1表達比例，結果顯示，與對照組相比，隱丹參酮組在各時間點Sca-1表達比例均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 25μM隱丹參酮干預KAL△LU24、48、72小時細胞干性標志物 Sca-1比較

圖3 25 μM隱丹參酮干預KAL△LU 24、48、72小時細胞Sca-1直方圖

3 討論

KAL△LU細胞株由美國國立癌癥研究所Dr. Yinling Hu實驗室創立，是從L-IKKαKA/KA自發性肺鱗癌小鼠將肺部鱗癌組織取出，經胰蛋白酶消化處理及分離培養建立而成[9]。KAL△LU細胞除具有鱗癌細胞特性外，還表達Sca-1等細胞干性標志物，與常見的肺鱗癌細胞株如H520有所不同，因此本研究以KAL△LU細胞株為研究對象，觀察隱丹參酮對KAL△LU細胞增殖、凋亡、周期以及干性標志物Sca-1的影響。

隱丹參酮是傳統中藥唇形科植物丹參的活性成分之一。本研究結果顯示，12.5、25、50 μM隱丹參酮在24、48、72小時均能抑制KAL△LU細胞增殖，具有濃度和時間依賴性，體現隱丹參酮有抗肺鱗癌細胞增殖潛力。已有多項研究[5-6，8，10]表明隱丹參酮在體外可抑制多種腫瘤細胞增殖。

細胞凋亡是由基因調控的細胞自主有序死亡，細胞凋亡過程失控與腫瘤發生有一定關系。隱丹參酮可通過阻滯細胞周期、線粒體途徑、其他途徑等多種機制誘導腫瘤細胞發生凋亡[11-12]。但在本研究中，以濃度為25 μM隱丹參酮作用于細胞各時間點，均未能顯示隱丹參酮對KAL△LU細胞有明顯促進凋亡作用，說明25 μM隱丹參酮并不能誘導KAL△LU細胞發生凋亡。

細胞正常的分裂、增殖、分化維持著機體的穩定，細胞周期調控紊亂會引起腫瘤等疾病，因此 “腫瘤可能是一類細胞周期性疾病”[13]，針對細胞周期素依賴性激酶、檢查點激酶等已成為研究熱點。在本實驗中，隱丹參酮干預48、72小時后可阻滯KAL△LU細胞于S期，從而阻斷細胞周期向G2/M進行。許多研究證實隱丹參酮可調控細胞周期。葉歡等[14]研究表明，40 μM隱丹參酮可將A549細胞周期阻滯于G1期。Chen等[15]也發現隱丹參酮干預乳腺癌和前列腺癌可使細胞周期阻滯于G0/G1期。

Sca-1是小鼠造血干細胞的標志物之一[16]，在多種組織器官如心臟、肝臟、乳腺等的干/祖細胞表面都有表達[17]。越來越多研究認為，Sca-1并非僅是干/祖細胞表面分子標志物，在其自我更新與分化以及促進腫瘤形成方面也起到重要作用[18-19]。有研究表明，在小鼠Lewis肺癌細胞(Lewis lung carcinoma，LLC)中，Sca-1+LLC比Sca-1-LLC成瘤性強，僅2 ×104即可成瘤，并且Sca-1+LLC耐藥性較 Sca-1-LLC更強[20-21]，提示Sca-1與腫瘤形成與腫瘤耐藥具有一定相關性。本研究結果表明，隱丹參酮干預后各時間點均可降低Sca-1比例，降低KAL△LU細胞干性。因此推測，隱丹參酮可能通過降低干性標志物Sca-1影響腫瘤形成、減少腫瘤耐藥。

綜上，隱丹參酮能抑制KAL△LU細胞增殖，具有濃度依賴性和時間依賴性，阻滯KAL△LU細胞周期于S期，降低KAL△LU細胞干性，在抑制肺鱗癌方面具有一定的潛力，為后續動物實驗提供一定參考。但隱丹參酮對KAL△LU細胞增殖、細胞周期以及Sca-1的直接作用機制尚不清楚，仍需進一步探索。