培土清心方降低人肥大細胞HMC1.1突變株與HMC1.2突變株細胞增殖活性及對HMC1.1突變株相關信號通路的影響研究

晏烽根 吳清 吳汶豐 劉俊峰 賈金靖 葉思祺 張瑜 莫秀梅 陳達燦

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)是最為常見的慢性炎癥性皮膚病，AD終生患病率高達20%，瘙癢是嚴重影響患者生活質量的因素之一[1]。瘙癢—搔抓的惡性循環可進一步破壞皮膚屏障，加重瘙癢和皮膚炎癥反應。肥大細胞在免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導的皮膚風團反應及其相關的AD瘙癢中至關重要，肥大細胞作為特應性皮炎的關鍵效應免疫細胞之一，通過增殖活化釋放炎癥介質或與神經系統的雙向相互作用參與了特應性皮炎的病理機制及療效作用[2-6]。基于特應性皮炎心火脾虛的中醫核心病機，筆者團隊總結形成了培土清心方，前期研究表明培土清心方可減輕特應性皮炎小鼠模型瘙癢癥狀及減少肥大細胞浸潤[7-8]，然而相關作用機制尚不清楚。研究顯示，肥大細胞增生與C-kit基因點突變尤其是Asp816Val(D816V)及 Val560Gly(V560G)的位點突變密切相關[9]，已廣泛采用細胞株HMC1.1(V560G位點突變)與HMC1.2(D816V和V560G兩個位點突變)用于開展研究[10]。故本研究通過體外實驗探討培土清心方對人肥大細胞HMC1.1突變株與HMC1.2突變株細胞增殖活性及對HMC1.1突變株相關信號通路的影響，為培土清心方治療特應性皮炎的療效機制提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及培養條件

人肥大細胞突變株HMC1.1：突變位點為C-kit蛋白中的560位點，由纈氨酸(Val)突變為甘氨酸(Gly)即：氨基酸密碼子由GTC到GGC(V560G)；人肥大細胞突變株HMC1.2(560，816)：突變位點為C-kit蛋白中的Val560Gly(V560G)及816位點，由天冬氨酸(Asp)突變為纈氨酸(Val)即：氨基酸密碼子由GAC到GTC(D816V)均購自美國Millipore。

細胞培養在10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的IMDM培養基中。細胞培養條件為37℃，5%的CO2條件下培養。

1.2 試驗藥物及其制備

培土清心方已獲得專利授權(專利號：ZL2013 1 0328668.4)，處方：白術10 g、連翹10 g、太子參10 g、白茅根15 g、白鮮皮10 g、山藥15 g、薏苡仁10 g、甘草5 g、珍珠粉0.3 g。培土清心方的浸膏由廣東省中醫院廣東省中醫藥科學院黎雄博士課題組自制(編號：20190103)，濃度為2 g/mL。復方配制為將100 mg 培土清心方浸膏溶于10 mL含10%FBS的IMDM完全培養基中，渦旋混勻后配置成10 mg/mL的培土清心方母液，過濾除菌后分裝于-20 ℃保存備用。各中藥單體購于成都曼思特生物科技有限公司。

1.3 主要儀器及試劑

超凈工作臺(ESCO公司)；水浴鍋(Thermo公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司，型號：CKX41)；二氧化碳培養箱(Thermo公司，型號：Thermo2838)；酶標儀(PerkinElmer公司，型號：VICTOR X5型)。

IMDM細胞培養基、FBS(Thermo公司)；2,4-二硝基甲苯(Sigma-Aldrich公司)；青霉素/鏈霉素雙抗(Millipore公司)；蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(Roche公司)；Phospho-C-kit(Y703)抗體、Phospho-C-kit(Y719)抗體C-kit抗體、Phospho-Stat1(Y701)抗體、Phospho-Stat3(S727)抗體、Stat1抗體、Stat3抗體(Cell signaIing technology公司)；Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)、鈣離子載體A23187、地塞米松(Sigma-Aldrich 公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(碧云天生物技術公司)。

1.4 Cell Counting Kit-8檢測培土清心方對細胞增殖活性的影響

將細胞接種于96孔板中，96孔板設立空白對照組、陰性對照組及實驗組。細胞種板密度為1×104個每孔100 μL。培土清心方實驗組設立不同濃度，分別為0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL，每個藥物濃度設3個復孔。作用時間點分別為24小時、48小時和72小時，實驗重復三次。在不同藥物濃度作用各時間點后加入10 μL每孔的CCK-8試劑，再孵育4小時后，酶標儀在波長450 nm檢測各孔吸光度。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測培土清心方對HMC1.1細胞C-kit/Stat信號通路的影響

取對數生長期的HMC1.1細胞接種于6 孔板，細胞密度為1.5×106個/mL，先加培土清心方各劑量處理2小時后，再加刺激劑培養24小時后棄去培養液，細胞實驗刺激劑為十四烷酰佛波醇乙酸酯(PMA，0.05 μmol/L)和鈣離子載體A23187(1.0 μmol/L)，細胞陽性對照藥為地塞米松(Dexamethasone, DEX, 0.1 μmol/L)。收集各組HMC1.1細胞，分別加入裂解液提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，待測樣品測定蛋白濃度后進行蛋白變性，然后取相同蛋白上樣量進行SDS-PAGE電泳，然后將電泳后的蛋白濕法電轉移至NC膜上。室溫封閉1小時后，經目標抗體4℃孵育過夜。然后洗膜3次，每次5 分鐘，加入相對應二抗(1∶ 5000)室溫孵育1小時，PBST 清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像。以GAPDH 抗體為內參，進行灰度值分析。 實驗重復3次。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 培土清心方降低肥大細胞HMC1.1與HMC1.2細胞增殖活性

培土清心方作用于HMC1.1和HMC1.2細胞24小時，與正常對照組比較，細胞增殖活性無顯著差異(P>0.05)。培土清心方0.25 mg/mL及高劑量作用于HMC1.1與HMC1.2細胞48小時后能顯著抑制細胞增殖(P<0.05)，并且呈現一定的劑量依賴性。培土清心方作用HMC1.1與HMC1.2細胞72小時也呈現劑量依賴性抑制細胞增殖活性作用。尤其是對HMC1.1細胞增殖抑制更為明顯，見表1、2。

2.2 培土清心方對HMC1.1細胞相關信號通路的影響

基于“2.1 培土清心方降低肥大細胞HMC1.1與HMC1.2細胞增殖活性”實驗結果，得出培土清心方對HMC1.1細胞抑制作用更加明顯，尤其是高劑量。因此，后期探討培土清心方作用的機制研究將采用HMC1.1細胞進行。

培土清心方對HMC1.1細胞作用8小時后，培土清心方可降低Phospho-C-kit(Y703)蛋白表達的趨勢，尤其在高劑量能明顯降低該蛋白表達，比地塞米松陽性藥組(DEX組)更加明顯，見圖1A、表3。同時，檢測了培土清心方對Phospho-C-kit(Y719)蛋白的作用，與刺激組(P/A組)比較，培土清心方各劑量組具有一定量降低Phospho-C-kit(Y719)蛋白表達的作用。尤其在培土清心方高劑量組，見圖1B、表4。

表3 培土清心方對Phospho-C-kit(Y703)及C-kit蛋白表達的影響

表4 培土清心方對Phospho-C-kit(Y719)及C-kit蛋白表達的影響

進一步檢測了C-kit/Stat信號通路的Stat相關蛋白。培土清心方作用HMC1.1細胞8小時的時間點下，培土清心方對Phospho-Stat1(Y701)/Stat1蛋白表達具有下調趨勢，尤其在培土清心方高劑量下調作用更加明顯，并且呈現劑量依賴性下調作用，見圖2A、表5。此外，檢測了培土清心方對Phospho-Stat3(S727)及Stat3的作用，培土清心方高劑量與刺激組(P/A組)比較無明顯差異，見圖2B、表6。

表2 培土清心方對HMC1.2細胞增殖活性的影響

注：A：培土清心方對Phospho-C-kit(Y703)及C-kit蛋白的作用；B：培土清心方對Phospho-C-kit(Y719)及C-kit蛋白的作用。圖1 培土清心方對HMC1.1細胞Phospho-C-kit及C-kit表達電泳圖

注：A：培土清心方對Phospho-Stat1(Y701)及Stat1蛋白的作用；B：培土清心方對Phospho-Stat3(S727)及Stat3蛋白的作用。圖2 培土清心方對HMC1.1細胞Phospho-Stat1、Stat1、Phospho-Stat3及Stat3表達電泳圖

表5 培土清心方對Phospho-Stat1(Y701)及Stat1蛋白表達的影響

表6 培土清心方對Phospho-Stat3(S727)及Stat3蛋白表達的影響

3 討論

中醫藥治療特應性皮炎可發揮抗菌消炎、抗變態反應和免疫調節作用，具有一定的優勢及特色[11]。培土清心方是我們團隊對特應性皮炎患者的長期臨床診治，從而總結形成的經驗方。處方現已獲得國家知識產權局專利保護授權(專利號：ZL2013 1 0328668.4)。前期培土清心方對特應性皮炎療效研究包括國家自然科學基金等多個課題進行了探討。既往的研究表明其發揮了多維度、多靶點的藥理作用。在臨床癥狀改善方面，培土清心方能明顯改善患者皮損嚴重程度[12-15]、瘙癢及睡眠[16]。且前期動物實驗表明，培土清心方可緩解特應性皮炎小鼠模型瘙癢癥狀及減少肥大細胞浸潤[7-8]。但培土清心方緩解瘙癢、減少肥大細胞浸潤的機制尚不明確，對HMC1.1及HMC1.2的增殖作用及相關機制亦無探討。

特應性皮炎也稱為特應性濕疹，是一種慢性炎癥性皮膚病，其主要的臨床特征為反復發作的濕疹樣皮損改變和劇烈瘙癢。特應性皮炎的病理機制涉及表皮屏障、皮膚微生物組異常和主要的2型炎癥免疫失調之間的復雜相互作用[17]。肥大細胞與 AD發病機制密切相關，研究表明，AD 患者皮膚中存在Th2細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，肥大細胞釋放多種物質，如類胰蛋白酶、組胺和白介素31(interleuk in-31,IL-31)，可與皮膚神經末梢的相應受體結合，產生瘙癢[18]。Yamashita 等[19]運用半抗原和賦形劑刺激肥大細胞缺陷 Kit Sl/Sl-d小鼠，以誘導AD模型，盡管小鼠出現表皮增厚和炎癥細胞浸潤的病理表現，以及IgE水平升高，但半抗原刺激的小鼠搔抓行為并未增強，這表明AD的瘙癢需要肥大細胞的參與。此外，IgE與肥大細胞上的特定受體FCεRI交聯，導致肥大細胞脫粒并釋放過敏性介質(組胺，前列腺素，白三烯，單核細胞趨化蛋白1，IL-6和IL-8)。這些過敏介質與TH1釋放的介質相互作用，加速了AD的疾病進程[20]。抗原/IgE 介導的肥大細胞活化是一個多步驟過程,FcεRI 介導的激活事件受其他表面受體(如 KIT、腺苷受體、前列腺素受體和許多其他受體)的參與調節[21]。故本研究以人肥大細胞HMC1.1及HMC1.2為研究模型，探討培土清心方對其增殖活性的影響，以期闡釋培土清心方緩解AD瘙癢的作用機制。

肥大細胞增殖與C-kit及其配體密切相關。C-kit 基因編碼跨膜受體酪氨酸激酶，C-kit基因產物在細胞生長和分化中具有重要功能。 C-kit的配體為一種新型生長因子，該因子也被稱為肥大細胞生長因子，現常稱為干細胞因子(Stem Cell Factor，SCF)。在人類皮膚中，肥大細胞和表皮黑色素細胞是僅有的表達 KIT 受體的細胞[22]。組織中肥大細胞數量的調節取決于從骨髓產生肥大細胞前體的速率和成熟肥大細胞在組織內的存活時間。肥大細胞在IL-3和 C-kit 配體(SCF)的影響下從骨髓發育而來。SCF 促進肥大細胞增殖可被其他細胞因子增強，如IL-4 和 IL-10[23]。SCF 與其受體 C-kit (CD117) 之間的相互作用具有酪氨酸激酶活性，可誘導細胞內信號傳導，促進肥大細胞的分化、增殖、趨化和成熟。缺乏 SCF 或 C-kit 的小鼠基本也缺乏肥大細胞 ，可見C-kit與 SCF 對肥大細胞的存活和發育起著關鍵作用[24]。

AD患者的苔蘚樣病變中可觀察到肥大細胞數量增加。由于 SCF 是肥大細胞最重要的有絲分裂原和化學引誘劑，SCF 與其受體C-kit的相互作用可能是 AD 病變中肥大細胞募集和增殖的重要事件。患者血清sSCF 和 sKIT 水平可能是評估AD 疾病活動度和嚴重程度的有用指標[25]。

本實驗采用Cell Counting Kit-8檢測法，研究培土清心方對肥大細胞HMC1.1與HMC1.2細胞增殖活性的影響，結果顯示培土清心方顯著抑制肥大細胞HMC1.1與HMC1.2細胞增殖活性，并呈劑量依賴性，其中HMC1.1的增殖活性抑制更為明顯。該結果表明，培土清心方可抑制肥大細胞增殖活性，從而為培土清心方緩解AD瘙癢及減輕肥大細胞浸潤提供依據。其對HMC1.1的增殖具有更強的抑制作用，可能與其V560G位點突變相關。

Kit的酪氨酸激酶活性對STAT信號激活至關重要，C-kit 的不同細胞內結構域參與了各種STAT蛋白的激活[26]。激活的 Kit可刺激MAPK、JAK-STAT和mTOR等細胞內通路。JAK2與C-kit 結合并在 SCF 刺激后磷酸化，JAK2激活導致 STAT 1α、STAT 3、STAT 5A 和STAT 5B的磷酸化[27]。其中，JAK3/STAT通路是 KIT(V560G) 的優先信號通路，而mTORC1/4E-BP1通路優先連接到 KIT(D816V)。這些關鍵信號通路的抑制導致程序性細胞死亡[28]。JAK-STAT信號通路在AD的病理生理機制中發揮重要作用[29]。在體外實驗中，IL-9 通過激活 STAT 3 刺激人肥大細胞產生 VEGF[30]。AD 動物模型中肥大細胞 VEGF 生成和血管生成的顯著增加也支持 JAK-STAT 在該免疫途徑中的作用[31-32]。

如上所述，JAK3/STAT通路是 KIT(V560G) 的優先信號通路，且肥大細胞增殖與C-kit及其配體密切相關。故本研究進一步利用Western Blot 檢測培土清心方給藥后對HMC1.1細胞的C-kit及Stat相關蛋白表達的影響。結果表明，培土清心方作用8小時后，各劑量組具有降低Phospho-C-kit(Y703)、Phospho-C-kit(Y719)蛋白表達的趨勢。故培土清心方可能通過減少C-kit蛋白的表達，從而抑制肥大細胞的增殖。此外，JAK-STAT作為其下游通路，蛋白免疫印跡法檢測結果亦表明，培土清心方對Phospho-Stat1(Y701)/Stat1蛋白表達具有下調趨勢，尤其在高劑量，其下調作用更加明顯，并呈現一定的劑量依賴性。

綜上所述，本研究利用HMC1.1及HMC1.2細胞模型，闡明培土清心方可顯著抑制HMC1.1及HMC1.2細胞增殖活性。培土清心方可能通過抑制C-kit/Stat信號通路，從而降低HMC1.1細胞的增殖活性。該研究為臨床應用培土清心方緩解特應性皮炎瘙癢癥狀提供新的理論基礎和研究方向。但本文仍有一定的局限性，需要開展進一步的動物實驗以驗證上述結果。