腎乳頭鈣化斑形成過程引起的腎臟損傷

鐘蛟 劉建和 劉浩然

腎乳頭鈣化斑，即Randall斑( Randall’s Plaques RP)，是晶體沉積的最終結果，在此之前腎髓質復合體早已開始形成礦物質聚集體。采用高分辨率顯微X射線計算機斷層掃描技術對非結石形成者的整個乳頭進行可視化分析，在超過70%的受檢者腎錐體內有礦物質沉積[1-2]。晶體沉積形成RP的過程中，晶體可通過炎癥和氧化損傷等機制來引起不同程度的腎臟損傷，深入探究RP形成及進展的機制，可為腎結石防治提供新的方向。

一、什么是腎乳頭鈣斑

1937年Randall[3]首先發現腎乳頭上皮組織下間質存在一種磷酸鈣成分的鈣化斑即Randall斑，進一步研究發現其為結石前病變，并提出游離顆粒學說和固定顆粒學說[4]。游離學說認為，腎小管過飽和尿液形成晶體阻塞集合管而形成Randall 栓(圖1a)。其主要成分是磷灰石，可作為結石附著生長的錨點[5-6]。固定顆粒學說認為，RP為始發于Henle細環的基底膜，逐漸延伸至腎髓質的間質，最后沉積在腎乳頭上皮下組織中的一種成分為磷灰石鈣鹽晶體(圖1b)。當尿路上皮被破壞時，RP成為結石形成的基石[7]。雖然兩種鈣化斑初始病灶位置不同，但其成分幾乎完全相同，可能是晶體形成過程中的兩種沉積形式。這兩種病變均可以在腎乳頭表面看到，但促進斑塊形成的原因尚不完全清楚。

圖1a 腎小管過飽和尿液經成核生長聚集后阻塞集合管后形成Randall栓 圖1b 晶體從Henle細環的基底膜開始逐漸延伸至腎乳頭上皮下間質聚集形成RP

二、Randall斑的形成機制

腎乳頭鈣化斑的具體發病機制仍不清楚。Evan等[8-9]通過大量研究證實，Henle環基底膜參與Randall斑塊形成。Khan等[10]推測腎乳頭中的晶體沉積可能是從膜泡誘導成核開始的，他們發現，斑塊形成與膠原蛋白、膜結合囊泡、膠原纖維鈣化和囊泡內含晶體都相關。Carpentier等[11]認為，非晶體化碳酸鈣是Randall斑形成的前體，不僅存在乳頭表面，也存在腎組織中。Taguchi等[12]首次報道Randall斑塊基因表達譜的研究，通過草酸鈣結石病人鈣斑及非鈣斑組織全基因組測序，發現眾多差異表達基因。鈣斑組織中LCN2、IL1L、PTGS1、GPX3及MMP等基因表達上調，SLC12A1和NALCN基因表達下調，而這些基因可能通過絲裂原蛋白激酶和PI3K/Akt通路誘導腎損傷、血管收縮、氧化應激、巨噬細胞來促進Randall斑塊的形成。這可能與晶體顆粒形成過程中引起細胞凋亡、腎臟損傷等密切相關。有趣的是，大多學者認為，RP起源于Henle細環的基底膜，由于這些研究大多都是乳頭活檢而來，對Randall斑形成的乳頭近端了解甚少，Hsi等[1]采用高分辨率顯微X射線計算機斷層成像技術對人腎髓質切片進行顯微X-射線成像，發現髓質復合體的外髓內近端晶體形成可促進遠端RP形成。

此外，一些學者也認為，成骨轉化學說和血管鈣化學說是Randall形成的機制之一。尿路結石和動脈粥樣硬化有許多共同的特征，動脈粥樣硬化是一種類成骨反應，將RP與血管鈣化進行比較，發現成分都是類似于骨成分的羥基磷灰石，故推測RP形成可能與局部缺氧等刺激腎乳頭上皮細胞向成骨細胞轉化有關[13]。Stoller等[14]提出的血管假說認為，湍流、相對缺氧和高滲的腎乳頭血管壁易受到損傷，其修復過程類似動脈粥樣硬化反應而導致腎乳頭血管壁鈣化，最終延伸至腎乳頭成為結石形成的原始病灶 。

三、Randall斑形成過程中晶體誘導的腎損傷

1.晶體誘導的直接和間接細胞毒性晶體可以直接對細胞產生毒性作用，腎小管細胞可以吞噬小于10 μm的晶體進入細胞內形成直徑吞噬小體，吞噬小體與溶酶體融合可消化部分晶體[15]。這一過程中將釋放大量的鈣離子到胞漿中從而觸發細胞壞死[16]。相反，溶酶體不能消化的顆粒將破壞溶酶體膜的穩定性，導致溶酶體酶(如組織蛋白B)泄漏到胞漿中，通過裂解免疫細胞中的壞死凋亡抑制蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(RIPK1)來激活壞死凋亡[17]；研究發現，草酸鈣、磷酸鈣及胱氨酸等晶體可通過激活受體相互作用的 RIPK3和混合譜系激酶結構域(mixed lineage kinase domain-like MLKL)來殺死腎小管上皮細胞，而在敲除RIPK3或MLKL的小鼠則免受晶體誘導腎臟損傷[18]，證實RIPK3和MLKL是介導腎細胞損傷的重要通路。晶體也可以通過壞死性炎癥間接引發腎小管細胞壞死，晶體誘導的細胞壞死導致危險相關的分子模式、高遷移率族蛋白1、組蛋白、線粒體DNA、去甲基化DNA和RNA、ATP、草酸和雙鏈DNA釋放到細胞外腔，這些因素可能通過與鄰近細胞表面的死亡受體結合來誘導相鄰細胞的程序性壞死(圖1)[19-20]。例如，草酸鹽(CaOx)晶體可直接損傷腎小管上皮細胞，導致ATP釋放和K+外流，激活產嘌呤能2X7受體( P2X7R)，繼而經還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和線粒體途徑使細胞內ROS水平升高， ROS通過NLRP3炎癥體來促進腎小管上皮細胞的炎癥損傷[21]。此外，組蛋白在細胞外具有很強的堿性電荷，會破壞鄰近活細胞的質膜，也會加重腎臟損傷。值得注意的是，研究發現,不同大小和形狀的晶體可引起中性粒細胞壞死性凋亡，但晶體誘導的中性粒細胞壞死凋亡是否與RP形成有關，至今仍不清楚[22]。

2.晶體誘導的腎臟炎癥損傷:如前所述，晶體通過改變線粒體功能，導致活性氧產生增加、溶酶體失穩、蛋白酶泄漏以及NLRP3炎癥小體等導致腎小管細胞壞死，從而致危險相關分子模式的釋放。晶體顆粒和危險相關分子也可激活Toll樣受體(TLR)，觸發樹突狀細胞和促炎巨噬細胞中炎癥小體的形成。同時，腎小管細胞壞死誘導細胞因子、激動素和脂質介質的表達，進一步促進血管擴張、血管通透性、白細胞流入和補體激活，從而增強腎臟炎癥，放大腎臟壞死性炎癥(圖2)，導致急性腎損傷(AKI)[17,23-24]；然而，晶體和/或壞死細胞碎片形成的管狀管型也可暫時阻塞管腔，導致腎小球濾過率和尿量突然下降也可致AKI[25]。

NLRP3炎癥小體是許多晶體引起炎癥的激活機制，參與CaOx晶體誘導的腎損傷及其上游的調節，由NLRP3炎性小體激活導致的細胞死亡稱為調節性細胞凋亡。晶體激活腎臟間質巨噬細胞和樹突細胞中的NLRP3炎癥小體分泌成熟IL-1β，從而直接引發腎臟炎癥(圖2)[19]。NLRP3炎性小體整合細胞內危險信號(K+外流、顆粒攝取、溶酶體溶解、ATP和ROS等)并激活Caspase-1，Caspase-1將pro-IL-1β裂剪接加工為具有活性的IL-1β，其釋放將炎癥信號傳遞給周圍的實質細胞，從而擴大腎臟壞死性炎癥[26-27]。同時，IL-1β通過其受體擴大后續炎癥效應，IL-1R激活NF-κB依賴的細胞因子和趨化因子的表達將進一步增強腎臟炎癥反應[28]。除了炎癥小體激活外，一些晶體還可以通過其他途徑引起炎癥：如尿酸晶體直接與細胞膜結合，以不依賴受體的方式誘導細胞表面脂質分類和酪氨酸蛋白激酶Syk的炎癥激活[29]。此外，一些炎性細胞因子(如TNFα)促使腎小管細胞壞死性調節，更是加重了草酸鹽晶體誘導的AKI[18]。值得注意的是，NLRP3炎性小體具有非炎癥性功能，可通過轉化生長因子β受體信號介導腎纖維化[30]。

圖2 晶體誘導壞死性炎癥的分子機制

巨噬細胞(Mφs)是至關重要的先天免疫細胞，可在各種刺激下誘導成具有不同功能的表型，其在晶體沉積過程中發揮重要作用。研究表明,M1Mφ通過氧化應激促進晶體沉積，而M2Mφ可抑制炎癥同時通過吞噬作用減少晶體沉積[31-32]，起到相互制衡作用(圖2)。Liu等[33]研究蘿卜硫素在體內外可能通過NRF2-miR93-φ/IRF1途徑促進M2Mφ極化，抑制CaOx沉積所致的腎小管上皮細胞炎性損傷。有學者認為,腎小管內沉積的晶體是經伸展運動進入間質，被單核Mφs和成纖維細胞識別并吞噬包裹后形成結晶肉芽腫[34]，但晶體觸發結晶性肉芽腫形成的分子機制至今尚不清楚。在一項高草酸飲食誘導的小鼠腎臟結晶研究中，用CSF-1誘導M2 Mφs可抑制小鼠腎臟晶體沉積[35]，有望用于RP形成的治療。研究還發現，雄激素受體缺失通過改變miR-185-5p/CSF-1信號改變Mφs募集M2Mφ極化抑制腎內草酸鈣晶體沉積[36]。

腎小管細胞吞噬晶體后，試圖在吞噬溶酶體中消化這些晶體，吞噬過程中導致胞漿中鈣離子釋放、鈣蛋白酶激活，繼而促進IL-1α的釋放，引發炎癥。然而，較大和難以消化的晶體會導致溶酶體不穩定，導致胞漿中Cat-B釋放；晶體直接損傷引起K+外流，經NADPH和線粒體途徑使ROS增加，組織蛋白酶B和ROS激活NLRP3，引起成熟IL-1β的分泌。組織蛋白酶B裂解RIPK1，導致Caspase通路介導的細胞凋亡，或者在Caspase-8缺失的情況下導致RIPK3和MLKL介導的調節性細胞壞死，引起細胞釋放各種與腎炎有關的分子和警報劑。同時，間質內可見樹突狀細胞和Mφs吞噬晶體，隨后溶酶體失穩釋放Cat-B和ROS，激活NLRP3炎性小體，誘導樹突狀細胞分泌成熟的IL-1β，觸發IL-1受體(IL-1R)依賴的腎臟炎癥。腫瘤壞死因子受體(TnFR)途徑可激活NF-κB，促進炎癥小體的激活，同時釋放炎癥因子和趨化因子。RIPK3和MLKL也可以激活NLRP3炎癥小體。某些促炎細胞因子也可以誘導鄰近活細胞中受調控的細胞死亡，從而建立一個壞死性炎癥的自動放大環路。

Randall斑的形成是一個從微觀到宏觀的過程，在此期間，晶體引起不同程度的腎損傷，涉及多種不同的病理機制。晶體顆粒過飽和促進腎小管內的結晶，導致腎小管阻塞、腎小管上皮細胞損傷及間質炎癥壞死，最終引起腎功能損傷。目前研究已發現,晶體性腎損傷炎癥免疫微環境中相關治療靶點，也有相應藥物誕生，未來有望從源頭上治療和預防腎結石的發生發展。