Xpert MTB/RIF 與改良羅氏比例法藥敏試驗檢測利福平藥敏的臨床價值

汪芹，紀小亭，黃鑫，曾東曉，秦安東，劉興祥

淮安市第四人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，江蘇淮安 223001

結(jié)核病是通過呼吸道傳播的一種傳染病，也是世界公認的一種感染性疾病，仍是全球前10 位死因之一。結(jié)核病疫情嚴重[1]，中國位列全球第二，僅次于印度。調(diào)查顯示，2020 年全球登記的肺結(jié)核患者480 萬例，其中59%為細菌學確診病例。2020 年全球診斷的580 萬結(jié)核病患者中，只有33%（190 萬/580 萬）使用了分子方法檢查（2019 年全球登記結(jié)核病710 萬）。近年來，由于結(jié)核病患者用藥不規(guī)范，初治或者反復治療，耐多藥結(jié)核病（multidrug resistance tuberculosis, MDR-TB）發(fā)生率越來越高。目前結(jié)核病診斷以及藥敏試驗的金標準仍是羅氏比例藥敏試驗檢測法，但培養(yǎng)法的陽性率低、時間長[2]，使結(jié)核患者未得到及時有效的治療。利用新技術和更先進的檢測設備如Xpert MTB/RIF、宏基因組二代測序[3]、DNA 微陣列[4]等可以及時有效的檢測出結(jié)核桿菌是否耐藥，成為結(jié)核病防治工作中當務之急[5]，為臨床治療提供更可靠的治療依據(jù)。因此，本研究選取2019 年7 月—2022 年4 月淮安市第四人民醫(yī)院246 例肺結(jié)核患者作為研究對象，對比Xpert MTB/RIF 和比例法藥敏試驗檢測利福平藥敏的臨床價值。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院住院或者門診肺結(jié)核患者痰液、肺泡灌洗液、胸水、組織液、膿分泌物、尿液、淋巴穿刺液和腦脊液等經(jīng)培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌為陽性的246 份標本，其 中 女67 例，男179 例；年 齡6～92 歲，平 均（48.8±20.6）歲。

1.2 方法

①改良羅氏比例法藥物敏感性試驗。將收集的標本經(jīng)過氫氧化鈉處理之后，接種于改良羅氏固體培養(yǎng)基上，常用羅琴培養(yǎng)基，由珠海貝索生物技術公司生產(chǎn)。將培養(yǎng)所得的純培養(yǎng)菌株作為受試菌株，用于結(jié)核桿菌藥敏檢測[6]，藥敏檢測步驟和結(jié)果報告按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》進行。

②Xpert MTB/RIF。結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因和突變檢測（實時熒光PCR 法）試劑盒由美國Cepheid 公司（批號1000272355）生產(chǎn)，Xpert MTB/RIF試驗按標準操作步驟進行。GeneXpert 以半巢式實時熒光定量PCR 技術[7]為基礎，在結(jié)核分枝桿菌特有的序列rpoB 基因上81bp 利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR），專門設計引物和5 條探針，檢測該序列是否發(fā)生突變，進而判別是否檢測到結(jié)核分枝桿菌，再檢測其對利福平耐藥情況。敏感性=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，特異性=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，采用χ2檢驗；一致性計算kappa 值評定。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測利福平藥敏結(jié)果比較

246 例樣本分別經(jīng)Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏試驗檢測利福平的耐藥率分別為14.6%（36/246）、11.4%（28/246），差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.15，P＞0.05）。見表1。

表1 Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏檢測利福平藥敏結(jié)果

2.2 兩種方法檢測利福平藥敏結(jié)果符合情況比較

以改良羅氏比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的敏感性為100.0%（28/28），特異性為96.3%（210/218），符合率96.7%（238/246），兩種方法一致性較好（Kappa=0.86）。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF 和改良羅氏比例法藥敏試驗檢測利福平藥敏符合率對比

2.3 Xpert MTB/RIF 檢測利福平基因位點突變分布情況分析

Xpert MTB/RIF 檢測的246 份樣本中，檢測出36例利福平耐藥，Xpert MTB/RIF 針對結(jié)核分枝桿菌的rpoB81bp 利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設計引物及5 條 探 針，包 括ProbeA(507～511)、ProbeB(512～518)、ProbeC(518～523)、ProbeD(523～529)、ProbeE(529～533)，Xpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥位點主要以探針ProbeE（63.9%，23/36）為主，集中在位點529～533 之間，ProbeA 和ProbeB 兩個耐藥位點同時耐藥有2 例。見表3。

表3 Xpert MTB/RIF 檢測利福平基因突變情況分析

3 討論

全球感染結(jié)核菌的人群中，絕大部分人感染結(jié)核分枝桿菌后因身體抵抗力較高而不會出現(xiàn)明顯的癥狀，即潛伏性結(jié)核感染，常用結(jié)核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test, TST）進行篩查[8]；少數(shù)人因免疫低[9]（如艾滋病、糖尿病患者）而出現(xiàn)相應的結(jié)核臨床癥狀和病灶，即活動性結(jié)核病。我國每年新發(fā)結(jié)核病人90 萬，其中耐多藥結(jié)核患者約7 萬，是高負擔結(jié)核病國家[10-12]，也是高負擔耐多藥結(jié)核病國家。利福平的單藥耐藥較少，據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示，MDR-TB 患者中約82%為RR-TB 患者，所以利福平耐藥結(jié)核病（rifampicin resistance tuberculosis,RR-TB）[13]可作為耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）的標志物[14-16]。所以在高科技發(fā)展的時代，利用新技術及時有效檢測結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥性是重中之重。

本研究結(jié)果中，比例法藥敏試驗顯示敏感而XpertMTB/RIF 顯示耐藥有8 例，原因可能是收集的246 例標本中MTB 檢測區(qū)的基因雖發(fā)生突變，但并沒有引起耐藥表型的改變。有研究指出，主要是因rpoB 基因突變導致結(jié)核分枝桿菌耐藥，基因突變導致編碼RNA 聚合酶異常突變[17]，導致空間構(gòu)象改變、氨基酸置換，導致利福平耐藥。比如，ropB 基因的533、531、526、522、516、513 或511 密碼子發(fā)生大部分突變，從而使大部分菌株有利福平的耐藥性，而密碼子507、508、517、521、523 或者532 發(fā)生突變的菌株，并不會導致比例法藥敏試驗檢測結(jié)核桿菌利福平的耐藥性。也有報道，患者感染混合菌株造成不同基因突變，這樣使利福平耐藥存在差別。

246 例患者標本檢測結(jié)果中，本研究未出現(xiàn)比例法藥敏試驗耐藥，而XpertMTB/RIF 敏感的病例。據(jù)報道，上述藥敏情況不符也有可能發(fā)生，原因可能為：①MTB 耐藥是由其他耐藥機制而非基因突變導致的，細菌細胞壁的通透性改變、細菌表達外排泵造成藥物的外排等。②MTB 耐藥可能由其他基因（非檢測區(qū)基因）的突變引起的。比如目前用基因法檢測inhA 和kaG 基因[18]的突變情況來判斷異煙肼是否耐藥，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，因inhA 和kaG 的基因突變產(chǎn)生的耐異煙肼MTB 只占到80%，還有20%可能與其他基因突變有關。

兩種方法檢測利福平是否耐藥可以指導臨床合理用藥，世界衛(wèi)生組織在2014 年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》中指出利福平藥敏試驗包括表型藥敏試驗和基因型藥敏試驗，任何一個方法發(fā)現(xiàn)耐藥都需要考慮耐藥的可能性，這是由于近年有報道表型藥敏試驗為敏感，但ropB 基因突變導致耐藥，患者采用一線抗結(jié)核藥物治療時，治療結(jié)果是失敗或復發(fā)的，應該使用二線抗結(jié)核藥物[19-20]。

Xpert MTB/RIF 是一種可以高效、準確地檢測結(jié)核分枝桿菌和檢測利福平耐藥性的方法，選擇結(jié)核分枝桿菌RRDR 作為檢測區(qū)域，在該序列區(qū)域發(fā)生突變超過95%，且集中于81bp 的核心區(qū)，而敏感株rpoB 核心區(qū)序列則基本一致。因此，rpoB 核心區(qū)突變能高度提示利福平耐藥。另外，由于rpoB 核心區(qū)兩側(cè)就是結(jié)核分枝桿菌特異性基因序列。因此，Xpert MTB/RIF 檢測技術給臨床提供了快速用藥治療的可能。

綜上所述，由于抗結(jié)核藥的不規(guī)范使用或者反復治療致使結(jié)核分枝桿菌容易出現(xiàn)耐多藥性，結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)耐多藥的菌株在臨床肺結(jié)核病例中出現(xiàn)比較頻繁，給人類帶來很大的危害。因此，應該利用現(xiàn)代最先進的分子生物學技術如Xpert MTB/RIF、DNA 微陣列、全基因組（WGS）測序技術等來檢測結(jié)核桿菌藥物敏感性，這樣能更及時有效地指導臨床合理用藥，避免耐藥菌株不斷的出現(xiàn)。完成2035 年終止結(jié)核的目標。相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)法藥物敏感試驗檢測時間長、操作繁瑣等缺陷，XpertMTB/RIF 檢測技術具備高靈敏度、高特異性、高集成化、高通量等特性。由于MTB 耐藥是由多種機制引起的復雜過程，單純的耐藥基因檢測并不能完全反應MTB 的實際耐藥情況，所以在實際應用中應綜合考慮。