液體培養(yǎng)法與熒光探針PCR 檢測陰道分泌物中解脲脲原體的應用價值

王敏，萬曉龍

1.江蘇省東臺市人民醫(yī)院檢驗科，江蘇東臺 224200；2.江蘇省東臺市人民醫(yī)院兒科，江蘇東臺 224200

支原體（mycoplasma）是最小的原核細胞型微生物，無細胞壁，形態(tài)多樣，可自細菌濾器濾過，生長繁殖于無生命培養(yǎng)基中[1-2]。目前，能夠從人體分離出的支原體共有16 種，其中7 種對人體有致病性，以解脲脲原體（ureaplasma urealyticum, UU）、人型支原體（mycoplasma hominis，Mh）最為常見[3-4]。可通過性接觸傳播，引起人類非淋球菌性和非衣原體性泌尿生殖道感染， 引起婦科疾病與不良妊娠結(jié)局[5-6]。目前，對UU 檢測臨床實驗室多采用液體培養(yǎng)基法，可直接檢測細菌。另外，還可使用核酸檢測的方法檢測UU[7-8]。基于此，本文選取江蘇省東臺市人民醫(yī)院檢驗科2019 年1 月—2021 年12 月收治的138 例疑似泌尿生殖道感染者，分別采用液體培養(yǎng)法、熒光探針PCR 法檢測，對檢測結(jié)果進行方法學對比，并探討聯(lián)合方式對疾病的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院檢驗科的138 例疑似泌尿生殖道感染的女性患者，年齡20～58 歲，病程2～12 個月。臨床癥狀：白帶增多、混濁、子宮頸水腫、充血或表面糜爛；累及尿道可見尿道口潮紅、充血；擠壓尿道可見分泌物外溢[9]。本研究所選病例經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或家屬知情同意。

1.2 納入與排除標準

納入標準：年齡22～50 歲；狀態(tài)良好，主動配合研究；資料完整，數(shù)據(jù)真實可靠。

排除標準：重要臟器功能受損者；惡性腫瘤患者；合并其他感染性疾病者；近期有過相關(guān)治療者；妊娠或哺乳期女性。

1.3 方法

所用儀器為ABI 7500 實時熒光定量PCR 分析儀。解脲脲原體核酸檢測試劑盒為圣湘生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

陰道分泌物檢測金標準為Amsel 臨床標準[10]，需滿足下列4 項中的其中3 項：線索細胞陽性（即數(shù)量占陰道上皮細胞總量的20%以上；胺試驗陽性；陰道分泌物pH 值＞4.5；陰道分泌物稀薄、灰白色，且質(zhì)地均勻；必備條件為線索細胞陽性。

以錯誤分析理論為指導，分析學生的在筆譯過程產(chǎn)生的語言錯誤，教師不僅可以把握學生的英語發(fā)展的不同階段，同時也能認識自身翻譯教學過程中的問題。更為重要的是，錯誤分析有助于檢驗學生譯文的語言知識點、百科知識以及文化知識的不足，這樣教師才能及時調(diào)整教學模式，學生也能調(diào)整自己的學習策略。總之，正如科德指出的那樣“錯誤研究方法，作為是了解語言學習過程中的必要方法，它有助于我們了解語言學習者的語言變化過程，還能反映出我們的學習者處于怎樣一個語言學習階段中”。[17]

1.3.2 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)取出所需數(shù)量的冷凍干燥培養(yǎng)基，滴加少量稀釋液到培養(yǎng)瓶中，充分搖勻至培養(yǎng)基完全溶解。補充滴加稀釋液，使液面至標簽標線處。在試劑條空白孔中加入50 μl 液體培養(yǎng)基。將采集的樣本插入培養(yǎng)基中，擠壓旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，使拭子中分泌物洗脫后棄拭子。充分混勻接種后的液體培養(yǎng)基，分別取50 μl 接種到試劑條余下各孔中。在試劑條的每1 孔中滴加1 滴石蠟油，蓋上蓋子。將剩余培養(yǎng)基連同試劑條放置35～37℃培養(yǎng)箱中孵育。

1.3.1 樣本采集所有患者采樣前2 h 內(nèi)不能排尿。采樣時，先清潔宮頸口過多的分泌物，將女性用無菌藻酸鈣拭子深入宮頸內(nèi)2～3 cm，用力轉(zhuǎn)1～2 圈后取出拭子。取出的分泌物應略帶黏膜，采集后的拭子置入無菌收集管中密封，立即送檢。每位患者需取兩份陰道分泌物樣本。

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以頻數(shù)與百分比（%）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

金標準顯示：138 例疑似患者中，確診患者110例；單一診斷方式特異性對比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法靈敏度和準確率高于熒光探針PCR 法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與單一診斷方式比較，聯(lián)合診斷靈敏度、特異度和準確率更高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

綜上所述,新生兒護理具有特殊性,而有效的安全護理有助于最大程度消除新生兒臨床不安全因素,降低不安全事件的發(fā)生率,需要臨床重視。

1.4 統(tǒng)計方法

核桃是我國能在國際市場上站穩(wěn)腳跟的少數(shù)農(nóng)副產(chǎn)品之一，特別是核桃油價格可達66元/kg，加之，核桃生產(chǎn)成本低，投入與產(chǎn)出比是1∶5，核桃果加工成仁能增值0.25倍，加工成油能增值2.5倍，加工成飼料能增值8倍，且收獲期長達60多年，產(chǎn)量穩(wěn)定，所以，核桃產(chǎn)業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景。

1.3.3 熒光探針PCR 檢測解脲脲原體核酸按照試劑說明書要求，取出試劑盒各組分平衡至室溫，混勻后備用；根據(jù)待測樣本數(shù)量，按比例混合反應液、酶混合液和內(nèi)標配制PCR 混合液，瞬時離心后備用；每孔PCR 反應管中加入核酸釋放劑5 μl 后，分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照各5 μl；加PCR 混合液40 μl 至每孔后，蓋上管蓋，2 000 rpm 離心30 s；設置PCR 循環(huán)參數(shù)進行擴增，PCR 反應條件為：50℃UNG 酶處理2 min，94℃預變性5 min，94℃變性15 s、57℃退火延伸30 s（共45個循環(huán)），25℃冷卻10 s；測定Ct 值≤38.5，擴增曲線呈典型S 型，同時內(nèi)標Ct值≤40，為解脲支原體陽性。

液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法報告獲取時間為（47.78±2.16）h，明顯長于熒光探針PCR 法的(25.12±1.44）h，差異有統(tǒng)計學意義（t=102.540，P＜0.001）。

2 結(jié)果

2.1 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)和熒光探針PCR 兩種檢測方法結(jié)果的比較

以Amsel 臨床診斷標準為金標準，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法對UU 的檢出率為76.09%，高于熒光探針PCR 法的57.25%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩種檢測方法結(jié)果的比較

2.2 單一檢測與聯(lián)合檢測的診斷價值比較

當有解脲脲原體生長時，24 h 觀察培養(yǎng)基由黃色變成紅色；當有人型支原體生長時，48 h 觀察培養(yǎng)基由黃色變成紅色。空白孔陰性表示試驗結(jié)果有效，可對其余各孔結(jié)果予以判定；空白孔陽性表示試驗過程中有污染，結(jié)果無效。

表2 單檢測與聯(lián)合檢測的診斷價值比較

2.3 兩種檢測方法報告獲取時間比較

2.3.1 HCC 結(jié)果(表2、表3)顯示：388例HCC患者中，腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦與否)是影響術(shù)后總體生存的獨立因素(P<0.05)；腫瘤數(shù)目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦與否)是影響術(shù)后復發(fā)的獨立因素(P<0.05)。

3 討論

本研究中熒光探針PCR 法解脲脲原體的檢出率為57.25%，低于液體培養(yǎng)法的76.09%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。造成檢出率差異的原因可能為：①解脲支原體的兩個亞型微小脲原體（ureaplasma parvum, Up）與解脲脲原體都能分解尿素，使培養(yǎng)酚紅指示劑變紅，因此液體培養(yǎng)法無法區(qū)分[11]。②液體培養(yǎng)基中所含抗菌藥物不能完全抑制陰道分泌物中復雜多樣的微生物，也可造成假陽性。③液體培養(yǎng)基法通過檢驗人員的肉眼判讀結(jié)果，易出現(xiàn)主觀因素導致的隨機誤差[12-13]。而熒光探針PCR 法可針對UU 設計特異性引物進行單項檢測，假陽性概率較低。除具有較強的特異性之外，熒光探針PCR 法還有較高的敏感性，最低檢出量僅為400 copies/mL；檢測時間短，只需數(shù)小時便可完成；污染率低，僅需加樣時開蓋，全封閉狀態(tài)操作等方法學的優(yōu)點，是目前臨床實驗室廣為應用的一種新型病原微生物檢測技術(shù)[14]。

北方的冬天，有著純潔的美。夜間下雪時，我總愛站在街燈下，頭向上仰望著，眼睛努力睜大，看著被燈光折射過的飛雪，雪花調(diào)皮地打在臉上，有些滲入衣服里，一陣冰涼的感覺傳來，可我卻感覺不到冷。路上的行人很少，雪地上只有一些稀稀疏疏的腳印，也許是因為都不忍心破壞這純潔無暇的美麗風景吧。眼前的路是一片潔白，似乎已經(jīng)鋪上了一條白地毯。雪花不時地飄到我的臉上，抬頭望去，每一片飛舞的雪花，在燈光的映射下，仿佛就是一簇簇從天上灑下來的銀屑。

傳統(tǒng)的液體培養(yǎng)法雖然方法學特異性不如熒光探針PCR 法，但其所檢測的只能是陰道分泌物標本中的活體支原體，可為疾病準確診斷以及療效跟蹤觀察提供實驗基礎(chǔ)。與此同時，該檢測方法操作相對簡單，還可檢測人型支原體，也是臨床實驗室不可或缺的解脲脲原體檢測手段[15]。學者馮米妹等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)法的檢出率為90.28%,明顯高于PCR 法的77.78%（P＜0.05），與文中結(jié)果一致。

文中對比聯(lián)合方式對疾病的診斷價值，結(jié)果顯示液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法聯(lián)合熒光探針PCR 法對疾病的診斷靈敏度、特異度和準確率高于單一診斷方式（P＜0.05），由此可見，解脲脲原體感染時，只選擇一種檢測方法有一定的局限性，而聯(lián)合傳統(tǒng)的液體培養(yǎng)法和熒光探針PCR 法兩種方法同時檢測，快速準確地鑒定解脲脲原體，也可在此基礎(chǔ)上準確診斷疾病，還能夠為療效監(jiān)測提供依據(jù)，優(yōu)勢互補更有利于指導臨床UU 感染的診斷和治療[17-18]。兩組報告獲取時間對比結(jié)果顯示，熒光探針PCR 時間更短（P＜0.05），24 h 左右即可獲得檢測結(jié)果，可為疾病早期診斷提供更為可靠的依據(jù)，便于疾病治療工作盡早開展，緩解患者壓力。

綜上所述，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)法和熒光探針PCR均可用于解脲脲原體感染診斷，二者聯(lián)合，可進一 步提高診斷價值。