分泌型卷曲相關蛋白1通過MAPK/ERK信號通路抑制結直腸癌細胞的遷移侵襲

雷建衛，汪媛，賀利榮

結直腸癌（CRC）是全球第三大最常見的癌癥類型［1］。盡管其發病率一直在穩步下降，其部分原因是診斷和治療方案的改善及社會風險因素暴露的減少，但結直腸癌的5 年預后生存率仍令人不甚滿意［2-3］。分泌型卷曲相關蛋白1（SFRP1）是一種Wnt/β-連環蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路抑制劑，其在抗癌藥的開發中具有重要作用［4］。SFRP1 被認為是一種WNT信號的抑制劑，其在許多腫瘤中表現出異常失調［5-7］。這說明SFRP1 的異常表達可能是WNT信號通路在腫瘤發生過程中被激活的重要機制。該基因在結直腸癌中雖已有研究報道，但其調控結直腸癌細胞遷移和侵襲的機制尚未十分清楚。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路在結直腸癌進展中的重要作用已得到許多研究的認可，但是其與SFRP1 基因之間的關系尚未明白。本研究起止時間2018 年11 月至2019年6月。本研究旨在探索SFRP1與MAPK/ERK 信號通路在結直腸癌進展中的關系。

1 材料與方法

1.1 材料正常結腸上皮細胞HCoEpiC、人結直腸癌細胞HCT8、SW480、RKO 購自ATCC；DMEM 培養基購自美國Selleck 公司；LipofectamineTM2000 購自北京宜科思源公司；BCA 蛋白定量試劑盒、反轉錄試劑盒均購自碧云天公司；PVDF 膜購自德國羅氏診斷有限公司；RIPA 蛋白裂解液購自Invent 公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將正常結腸上皮細胞HCoEpiC、人結直腸癌細胞HCT8、SW480、RKO 用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃，5%二氧化碳的恒溫培養箱中常規培養，待細胞生長至融合度75%左右，用胰蛋白酶消化約1 min，按照1∶3 的比例更換培養基，每2天傳代一次。

1.2.2 細胞轉染與分組 將正常培養的HCT8 細胞隨機分成pcDNA 3.1 組（轉染pcDNA 3.1）、pcDNA 3.1-SFRP1 組（轉染pcDNA 3.1-SFRP1）、pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO 組（共 轉 染pcDNA 3.1-SFRP1 和DMSO）、pcDNA 3.1-SFRP1+IGF1 組（共轉染pcDNA 3.1-SFRP1 和IGF1），按照LipofectamineTM2000 轉染試劑盒說明書操作，轉染至HCT8 細胞。用qRTPCR法檢測轉染效率，轉染成功后用于后續試驗。

1.2.3 qRT-PCR 法檢測細胞中SFRP1 的mRNA 表達 取適量細胞，用RNA 抽提試劑盒提取總RNA，然后用逆轉錄試劑盒合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進行SFRP1 檢測。以GAPDH 為內參，2-ΔΔCt計算SFRP1 的表達。ΔΔCt=［（CTCTSFRP1-CTGAPDH）Treatmentgroup-（CTCTSFRP1-CTGAPDH）Controlgroup］。每個樣本做3 個復孔，實驗重復3 次。引物信息（5'-3'）：SFRP1 正向引物TGACTTCAGGTCAAGGGATGGT，反向引物ACATCGCTTGAGGATCTGGAA；GAPDHF正向引物TGGGTGTGAACCATGAGAAGT，反向引物TGAGTCCTTCCACGATACCAA。

1.2.4 Western blotting 檢測細胞中的蛋白表達 檢測SFRP1、波形蛋白（Vimentin）、纖維黏連蛋白（FN）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、MAPK/ERK信號通路關鍵基因（Ras）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化細胞外信號調節激酶1/2（p-ERK1/2）、細胞外信號調節激酶（ERK）的蛋白表達。

收集細胞，用裂解液充分裂解，提取總蛋白，進行BCA 法定量，再用沸水浴變性處理10 min。取上清進行上樣，蛋白電泳。電泳結束后用轉膜儀將蛋白濕轉移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4 ℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4 ℃2 h。加發光液，曝光。用Quantity One 軟件處理條帶的灰度值，目的條帶灰度值與內參GAPDH 灰度值的比值表示目的蛋白的表達情況。

1.2.5 Transwell 小室檢測細胞的遷移和侵襲 將Transwell 小室置于孔上，放入細胞培養箱平衡30 min。然后將各組細胞消化，用純RPMI 1640培養基配制成5×105個/毫升的細胞懸液。每個小室加入200 μL 細胞懸液，即每孔細胞約為1×105個。每組設置3個復孔，將24孔板放入37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養24 h 后，取出上腔，用棉簽擦去上室膜上未遷移的細胞，PBS 洗2 次，甲醇固定30 min。自然晾干后，用1 g/L 結晶紫染液染色20 min。棄染液，雙蒸水洗2 次。取出后于倒置顯微鏡下觀察拍照（400倍），計數上、下、左、右、中5個不同視野的總細胞數取平均值。

將轉染成功的對數期細胞進行Transwell 侵襲實驗。將基質膠和RPMI 1640 培養基按1∶8 稀釋后（60 μL）鋪于培養小室上，風干后備用，其他步驟同Transwell體外遷移實驗。

1.3 統計學方法實驗中所有數據均采用SPSS 21.0 軟件進行分析，使用GraphPad Prism 6.0 進行相關圖片的繪制。計量資料用表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析，用LSD-t法進行兩組間的比較，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SFRP1 在結直腸癌細胞中的表達與HCoEpiC相比，HCT8、SW480、RKO細胞中SFRP1 mRNA和SFRP1 蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）。其中HCT8對SFRP1 的變化差異最顯著，故選用該細胞用于后續實驗。見圖1、表1。

表1 SFRP1在結直腸癌細胞中的表達/

表1 SFRP1在結直腸癌細胞中的表達/

注：SFRP1 為分泌型卷曲相關蛋白1，HCoEpiC 為正常結腸上皮細胞，HCT8、SW480、RKO均為人結直腸癌細胞。①與HCoEpiC比較，P＜0.05。

圖1 SFRP1蛋白在結直腸癌細胞中的表達

2.2 過表達SFRP1 對結直腸癌細胞遷移、侵襲的影響與pcDNA 3.1組相比，pcDNA 3.1-SFRP1組細胞中SFRP1mRNA 表達顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 過表達SFRP1對結直腸癌細胞遷移、侵襲的影響/

表2 過表達SFRP1對結直腸癌細胞遷移、侵襲的影響/

注：pcDNA 3.1為轉染pcDNA 3.1，pcDNA 3.1-SFRP1為轉染pcDNA 3.1-SFRP1，SFRP1為分泌型卷曲相關蛋白1。

2.3 過表達SFRP1 對結直腸癌細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響與pcDNA 3.1 組相比，pcDNA3.1-SFRP1 組細胞中SFRP1 mRNA 表達顯著升高，Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的蛋白表達量均顯著降低，SFRP1、E-cadherin 的蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 過表達分泌型卷曲相關蛋白1（SFRP1）對結直腸癌細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響

表3 過表達SFRP1對結直腸癌細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響/

表3 過表達SFRP1對結直腸癌細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響/

注：pcDNA 3.1 為轉染pcDNA 3.1，pcDNA 3.1-SFRP1 為轉染pcDNA 3.1-SFRP1，SFRP1 為分泌型卷曲相關蛋白1，Vimentin 為波形蛋白，FN為纖維黏連蛋白，MMP-9為基質金屬蛋白酶9，E-cadherin為上皮鈣黏蛋白，N-cadherin為N-鈣黏蛋白。

2.4 過表達SFRP1 抑制MAPK/ERK 信號通路的活性與pcDNA 3.1組相比，pcDNA 3.1-SFRP1組細胞中Ras、mTOR、ERK1/2、p-ERK1/2、ERK 的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見圖4、表4。

表4 過表達SFRP1對MAPK/ERK信號通路活性的影響/

表4 過表達SFRP1對MAPK/ERK信號通路活性的影響/

注：pcDNA 3.1 為轉染pcDNA 3.1，pcDNA 3.1-SFRP1 為轉染pcDNA 3.1-SFRP1，SFRP1 為分泌型卷曲相關蛋白1，Ras 為絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶（MAPK/ERK）信號通路關鍵基因，mTOR 為雷帕霉素靶蛋白，ERK1/2 為細胞外信號調節激酶1/2，p-ERK1/2 為磷酸化細胞外信號調節激酶1/2，ERK為細胞外信號調節激酶。

圖4 過表達分泌型卷曲相關蛋白1（SFRP1）的HCT8細胞中絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶（MAPK/ERK）信號通路相關蛋白的表達

2.5 激活MAPK/ERK信號通路對SFRP1抑制結直腸癌細胞遷移侵襲的影響與pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO組相比，pcDNA3.1-SFRP1+IGF1組細胞中SFRP1 mRNA的表達顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著升高，Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的蛋白表達量均顯著升高，SFRP1、E-cadherin的蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。見圖5、圖6、表5。

表5 激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶（MAPK/ERK）信號通路對SFRP1抑制結直腸癌細胞遷移侵襲的影響/

表5 激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶（MAPK/ERK）信號通路對SFRP1抑制結直腸癌細胞遷移侵襲的影響/

注：pcDNA 3.1-SFRP1為轉染pcDNA 3.1-SFRP1，pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO 為共轉染pcDNA 3.1-SFRP1和DMSO，pcDNA 3.1-SFRP1+IGF為共轉染pcDNA 3.1-SFRP1 和IGF，SFRP1 為分泌型卷曲相關蛋白1，Vimentin 為波形蛋白；FN 為纖維黏連蛋白，MMP-9 為基質金屬蛋白酶9，Ecadherin為上皮鈣黏蛋白，N-cadherin為N-鈣黏蛋白。①與pc DNA 3.1-SFRP1+DMSO組比較，P＜0.05。

圖6 結直腸癌細胞遷移侵襲相關蛋白的表達

3 討論

SFRP1 位于8p12-11.1 號染色體，是WNT 信號通路的負調控因子之一，其被轉錄為35-kDa糖蛋白［8］。SFRP1 由兩個富含半胱氨酸的結構域組成，這兩個結構域稱為netrin 和CRD，它們與卷曲受體有關［9］。SFRP1 由于沒有跨膜結構域而被釋放到細胞外空間，可以通過與卷曲蛋白競爭性結合而阻斷WNT信號通路的激活［10］。Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin這些均為上皮細胞發生間質化轉移的重要參與基因，與細胞的遷移和侵襲能力緊密相關，也與細胞中Wnt-βcatenin信號通路的活性相關［11-12］。

據報道，SFRP1的表達在多種人類癌癥類型中都下調［13］。吳瓊等［14］在結直腸癌的研究中報道，5-氮雜-2'-脫氧胞苷可抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并上調SFRP1，進而抑制Wnt/β-catenin 信號通路和上皮間質化。由此推測，SFRP1的上調可能也可抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲。本研究通過qRT-PCR、Western blotting 檢測了結直腸癌細胞中SFRP1 的表達，發現SFRP1在結直腸癌細胞中異常下調表達，這與前人關于SFRP1在各種腫瘤中的表達水平是相一致的；進一步研究發現，過表達SFRP1可抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲，并下調Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin的表達，上調E-cadherin的表達，這說明SFRP1可直接抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲，產生這種作用的機制與下調Vimentin、FN、MMP-9、N-cadherin 的表達，上調E-cadherin的表達具有相關性；深入研究發現，SFRP1 可抑制MAPK/ERK 信號通路的活性，推測SFRP1的功能除了與WNT信號通路的活性有關外，還可能與MAPK/ERK信號通路有關。

絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated proteinkinase，MAPK）信號通路由四個不同的級聯通路相聯系，包括細胞外信號相關激酶（ERK1/2）、Jun氨基末端激酶（JNK1/2/3）、p38-MAPK 和ERK5［15］。據報道，MAPK/ERK 通路與細胞增殖、分化、遷移和凋亡有關［16］。MAPK/ERK信號通路關鍵基因包括Ras、mTOR、ERK1/2、p-ERK1/2、ERK 等［17］。Han 等［18］在結直腸癌的研究中發現，MAPK/ERK信號通路在結直腸癌中可被原癌基因B淋巴細胞白血病前體蛋白轉錄因子3抗體（PBX3）異常激活，進而有益于PBX3的促癌功能。Dahlmann等［19］報道，晚期糖基化終產物（RAGE）與結直腸癌轉移的預后生物標志物S100A4相互作用，可直接導致過度活化的MAPK/ERK信號通路失活，進而參與結直腸癌的遷移、侵襲調控。本研究結果顯示，過表達SFRP1可抑制MAPK/ERK信號通路的活性，深入研究發現，激活MAPK/ERK信號通路可逆轉SFRP1對結直腸癌細胞遷移侵襲的抑制作用，這說明該通路參與SFRP1在結直腸癌中的功能。

綜上所述，過表達SFRP1 可抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲，其機制與抑制MAPK/ERK 信號通路的活性有關，為結直腸癌的治療提供參考。

（本文圖2，5見封三）

圖2 過表達SFRP1對結直腸癌細胞遷移、侵襲的影響

圖5 激活MAPK/ERK信號通路對結直腸癌細胞遷移侵襲的影響