miR-568通過下調AKR1B10表達影響膠質母細胞瘤細胞的增殖和凋亡

姚慶東，張福生，張國順，殷會詠，張一平，孟艷舉

膠質母細胞瘤是常見的原發(fā)性腦部腫瘤，中位生存期約為12 個月，具有較高的病死率［1］。該疾病的治療主要是外科手術輔助放、化療［2］，但目前的治療方法并不能改善病人的長期生存率。從分子水平了解膠質母細胞瘤的發(fā)病機制并尋找有效的治療靶點對于提高治療療效、改善病人生存期具有積極意義。miR-568 是一種在乳腺癌中表達下調的微小RNA（miRNA），miR-568 表達的下調促進乳腺癌轉移［3］。但目前，miR-568 在膠質母細胞瘤中的作用還未知。生物信息學軟件預測顯示，醛酮還原酶家族1 成員B10（AKR1B10）可能是miR-568的靶基因。AKR1B10 主要表達于正常的消化道上皮中，而在其他組織中不表達或表達水平極低［4］。張茜［5］研究顯示，AKR1B10 在神經膠質瘤組織中的表達水平高于正常腦組織，其表達水平與膠質瘤大小呈正相關，過表達AKR1B10 可促進神經膠質瘤細胞的增殖。

本研究自2018 年12 月至2019 年7 月，探討了miR-568 能否靶向AKR1B10 調控膠質母細胞瘤細胞增殖和凋亡，以期為該腫瘤的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑正常星形膠質細胞HA1800及膠質母細胞瘤細胞U251、T98G 和SHG44，中國科學院上海細胞庫；四甲基噻唑藍（MTT），美國Sigma 公司；胎牛血清，浙江天杭；雙熒光素酶活性檢測試劑盒、RPMI 1640培養(yǎng)基和BCA蛋白測定試劑盒，北京索萊寶；PCR 實驗相關試劑盒，大連寶生物；蛋白質印跡實驗所需，中國Abcam 公司；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen 公司；引物序列、miR-568 模擬物（mimics）和抑制劑（anti-miR-568）、AKR1B10 小干擾RNA（si-AKR1B10）及小干擾RNA陰性序列（si-NC）、模擬對照序列（miR-NC）和抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）、AKR1B10 過表達載體（pcDNA-AKR1B10）和空載體（pcDNA）、AKR1B10野生型（WT）和突變型（MUT）熒光素酶報告基因載體，上海生工。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 正常星形膠質細胞HA1800、膠質母細胞瘤細胞系（U251、T98G 和SHG44）均用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基）培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉染 接種U251 細胞于6 孔板中，接種個數為1.0×105個/孔。培養(yǎng)24h后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別轉染miR-568 mimics（miR-568 組）、miR-NC（miR-NC 組）、anti-miR-568（anti-miR-568 組）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 組）、si-AKR1B10（si-AKR1B10 組）、si-NC（si-NC 組）、共轉染miR-568 mimics 與pcDNA-AKR1B10（miR-568+pcDNA-AKR1B10 組）、miR-568 mimics 與pcDNA（miR-568+pcDNA 組），轉染時間為12 h。檢測細胞中miR-568 或AKR1B10 表達，驗證轉染效果后，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 qRT-PCR 檢 測miR-568 和AKR1B10 mRNA表達 Trizol 試劑提取細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA 后，進行擴增。擴增程序：設置溫度為95 ℃，預變性5 min；然后95 ℃進行變性（時間為10 s），之后設置溫度為60 ℃進行退火（時間30 s），最后設置溫度為72 ℃延伸（時間30 s），并重復此過程，共35 個循環(huán)。miR-568 正向引物5'-ATGTATAAATGTATACACAC-3'，反向引物5'-GTGTGTATACATTTATACAT-3'；AKR1B10正向引物5'-TCATACGGATCCACCATGGCCACGTTTGT-3'，反向引物5'-CTGCTCGAATTCTCAATATTCTGCATTGAAGGGAT-3'；U6 正向引物5'-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3'，反向引物5'-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3'；GAPDH正向引物5'-CATCGAGCACGGCATCGTCA-3'，反向引物5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'。用2-ΔΔCt法計算miR-568相對U6、AKR1B10 mRNA相對GAPDH的表達。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測AKR1B10、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達RIPA試劑提取各組細胞中總蛋白，經BCA 法測蛋白濃度后，利用SDS-PAGE 實驗進行分離。將分離蛋白先轉至PVDF 膜，放于5%脫脂奶粉中進行封閉（時間為1 h）。然后于4 ℃冰箱中，分別放置在沉默醛酮還原酶家族1 成員B10（AKR1B10）（1∶500）、細胞周期蛋白1（CyclinD1）（1∶500）、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（p21）（1∶50）、B 細胞淋巴癌/白血病-2 基因（Bcl-2）（1∶100）、前凋亡蛋白（Bax）（1∶100）和甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗中孵育過夜。洗膜后，再放在山羊抗兔二抗（1∶200）中孵育（37 ℃、1 h）。加顯影液顯影，曝光拍照。

1.2.5 MTT 檢測細胞增殖 接種轉染后細胞至96孔板中，接種個數均為1.0×104個/孔板中。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加5 g/L MTT（每孔20 μL），孵育4 h。棄培養(yǎng)基，加二甲基亞砜（每孔150 μL），混合均勻。將96 孔板設入酶標儀卡槽中，設置波長為490 nm，測定吸光度（OD）值。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 接種轉染后細胞至24 孔板中，接種個數均為5.0×104 個/孔。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，收集各組細胞。嚴格按照Annexin VFITC/PI試劑盒操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗 接種U251 細胞于6 孔板中，接種個數為1.0×105個/孔。培養(yǎng)24 h后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別共轉染miR-568 mimics 與AKR1B10-WT（或AKR1B10-MUT）、miR-NC 與AKR1B10-WT（或AKR1B10-MUT），轉染時間為12 h。然后裂解各組細胞，3 500 r/min 離心10 min。取20 μL 上清液，加100 μL 1×螢火蟲或海腎熒光素酶反應工作液，混合均勻，檢測螢火蟲或海腎的熒光強度。用螢火蟲與海腎熒光強度的比值表示細胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法SPSS 22.0 軟件分析實驗數據。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-568 和AKR1B10 在膠質母細胞瘤細胞系中的表達膠質母細胞瘤細胞系（U251、T98G 和SHG44）中miR-568 表達均低于HA1800 細胞（P＜0.05），AKR1B10 mRNA 和蛋白表達均高于HA1800細胞（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 miR-568和AKR1B10在膠質母細胞瘤細胞系中的表達/

表1 miR-568和AKR1B10在膠質母細胞瘤細胞系中的表達/

注：HA1800 為正常星形膠質細胞，U251、T98G、SHG44 均為膠質母細胞瘤細胞，miR-568為微小RNA-568，AKR1B10 mRNA為醛酮還原酶家族1 成員B10 基因，AKR1B10 為醛酮還原酶家族1 成員B10蛋白。①與HA1800細胞比較，P＜0.05。

圖1 膠質母細胞瘤細胞系中AKR1B10蛋白表達

2.2 miR-568 靶向調控AKR1B10的表達AKR1B10 的3’UTR 與miR-568 互補的核苷酸序列見圖2A。

共轉染miR-568 mimics 與AKR1B10-WT 的U251 細胞熒光素酶活性為（0.43±0.03），較共轉染miR-NC與AKR1B10-WT的U251細胞熒光素酶活性（1.01±0.09）顯著降低（t=17.60，P＜0.05）；共轉染miR-568 mimics 與AKR1B10-MUT 的U251 細 胞熒光素酶活性為（1.02±0.09），與共轉染miR-NC與AKR1B10-WT 的U251 細胞熒光素酶活性（1.04±0.08），比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.36，P=0.727）。

miR-568組AKR1B10蛋白表達量為（0.24±0.03），較miR-NC 組0.61±0.06顯著降低（t=16.55，P＜0.05）；anti-miR-568組AKR1B10蛋白表達量為（0.96±0.08），較anti-miR-NC組（0.58±0.05）顯著升高（t=12.08，P＜0.05），見圖2B。

圖2 miR-568靶向調控AKR1B10的表達：A為AKR1B10的3’UTR與miR-568互補的核苷酸序列；B為miR-568對AKR1B10蛋白表達的影響

2.3 上調miR-568 對U251 細胞增殖和凋亡的影響miR-568在miR-568 組U251 細胞中的表達量為2.38±0.24，較miR-NC組1.01±0.08顯著升高（t=22.46，P＜0.05）。miR-568 組U251 細胞培養(yǎng)48 h、72 h 后的OD 值，較miR-NC 組均降低（P＜0.05），見表2。miR-568組U251細胞凋亡率為［（22.41±2.15）%］，較miR-NC 組（6.58±0.67）%，升 高（t=21.07，P＜0.05），見圖3。

圖3 上調miR-568對U251細胞增殖、凋亡的影響：A為上調miR-568的U251細胞中增殖、凋亡相關蛋白表達；B為流式細胞儀檢測上調miR-568的U251細胞凋亡

表2 上調miR-568對U251細胞增殖（波長為490 nm時測定吸光度）的影響/

表2 上調miR-568對U251細胞增殖（波長為490 nm時測定吸光度）的影響/

注：miR-NC為微小RNA-568陰性對照，miR-568為微小RNA-568。

同時，miR-568 組U251 細胞中增殖和凋亡相關蛋白CyclinD1 和Bcl-2 表達均低于miR-NC 組［CyclinD1：（0.32±0.03）比（0.78±0.07），t=18.44，P＜0.05；Bcl-2：（0.29±0.03）比（0.67±0.07），t=16.29，P＜0.05］，p21 和Bax 表達均高于miR-NC 組［p21：（0.58±0.05）比（0.22±0.03），t=18.88，P＜0.05；Bax：（0.72±0.07）比（0.31±0.03），t=16.66，P＜0.05］。

2.4 下調AKR1B10 對U251 細胞增殖和凋亡的影響AKR1B10 蛋白在si-AKR1B10 組U251 細胞中的表達量為0.28±0.03，較si-NC 組0.63±0.06 顯著降低（t=15.11，P＜0.05）。si-AKR1B10 組U251 細胞培養(yǎng)48 h、72 h 后的OD 值均較si-NC 組均降低（P＜0.05），見表3。

表3 下調AKR1B10對U251細胞增殖的影響/

表3 下調AKR1B10對U251細胞增殖的影響/

注：si-NC 為陰性對照，si-AKR1B10 為沉默醛酮還原酶家族1 成員B10基因。

si-AKR1B10 組U251細胞凋亡率為（21.26±2.14）%，較si-NC 組（8.02±0.78）%升高（t=17.42，P＜0.05），見圖4。

圖4 下調AKR1B10的U251細胞中增殖、凋亡相關蛋白表達

同時，si-AKR1B10 組U251 細胞中增殖和凋亡相關蛋白CyclinD1和Bcl-2表達均低于si-NC 組［CyclinD1：（0.35±0.03）比（0.76±0.07），t=17.13，P＜0.05；Bcl-2：（0.32±0.03）比（0.69±0.07），t=15.12，P＜0.05］，p21 和Bax 表達均高于si-NC 組［p21：（0.56±0.05）比（0.21±0.03），t=16.59，P＜0.05；Bax：（0.67±0.07）比（0.29±0.03），t=14.65，P＜0.05］。

2.5 上調AKR1B10 逆轉上調miR-568 對U251 細胞增殖和凋亡的影響miR-568+pcDNA-AKR1B10組U251 細胞培養(yǎng)48 h、72 h 后的OD 值、CyclinD1 和Bcl-2蛋白表達均高于miR-568+pcDNA組（P＜0.05），凋亡率、p21和Bax蛋白表達均低于miR-568+pcDNA組（P＜0.05）。見圖5、表4。

圖5 AKR1B10和增殖、凋亡相關蛋白表達

表4 上調AKR1B10逆轉了上調miR-568對U251細胞增殖和凋亡的影響/

表4 上調AKR1B10逆轉了上調miR-568對U251細胞增殖和凋亡的影響/

注：miR-NC 為微小RNA-568 陰性對照，miR-568 為微小RNA-568，miR-568+pcDNA 為微小RNA-568 過表達轉染真核細胞的表達空載體，miR-568+pcDNA-AKR1B10為微小RNA-568過表達轉染真核細胞的表達醛酮還原酶家族1成員B10基因載體。①與miR-NC組比較，P＜0.05。②與miR-568+pcDNA組比較，P＜0.05。

3 討論

膠質母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展與多種編碼基因和非編碼基因的異常表達密切相關［6-7］。研究表明，膠質母細胞瘤中存在大量異常表達的miRNA，如miR-199a-5p、miR-628-5p 和miR-423-5p，這些miRNA 參與膠質母細胞瘤細胞的惡性生物學行為，是膠質母細胞瘤治療的潛在分子靶點［8-10］。作為一種miRNA，miR-568 在腫瘤中的表達及其對腫瘤細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響也被廣泛關注。雷桃香［11］研究顯示，miR-568靶向抑制CDK4的表達阻礙宮頸癌細胞增殖；李俊堂［12］研究顯示，miR-568 是乳腺癌細胞中表達下調的一種miRNA，上調miR-568對乳腺癌細胞增殖和遷移起抑制作用。

本研究顯示，miR-568 在膠質母細胞瘤細胞的表達較正常星形膠質細胞明顯降低，提示miR-568參與膠質母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展；進一步上調母細胞瘤細胞中miR-568 的表達引起細胞增殖能力降低，而凋亡加劇，同時導致細胞中增殖、凋亡相關蛋白CyclinD1 和Bcl-2 表達降低，而p21 和Bax 表達升高，這提示上調miR-568 可能抑制膠質母細胞瘤的發(fā)展，miR-568 有可能成為膠質母細胞瘤治療的分子靶點。

AKR1B10 基因位于7 號染色體長臂3 區(qū)3 帶，是一種致癌基因。Wang 等［13］研究顯示，AKR1B10表達的上調通過促進肝癌細胞的細胞周期進程來促進肝癌細胞生長。Zhou 等［14］研究顯示，沉默AKR1B10 表達肺癌細胞的增殖和侵襲能力降低，細胞周期阻滯，AKR1B10 可能是肺癌的潛在診斷和治療靶點。Xiao 等［15］研究顯示，過表達AKR1B1可通過ERK1/2 途徑促進胰腺癌細胞增殖，并抑制細胞凋亡。本研究結果顯示，AKR1B10 在膠質母細胞瘤細胞中的表達水平明顯高于正常星形膠質細胞，下調AKR1B10 表達可抑制膠質母細胞瘤U251 細胞增殖，并誘導其凋亡，提示下調AKR1B10有可能延緩膠質母細胞瘤的發(fā)展進程。為探究miR-568 抑制膠質母細胞瘤細胞增殖及促進其凋亡的分子機制，本研究證實了miR-568 靶向結合并負調控AKR1B10。此外，本研究利用恢復實驗發(fā)現(xiàn)，上調AKR1B10逆轉了上調miR-568對膠質母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響，提示miR-568 通過靶向下調AKR1B10來影響膠質母細胞瘤細胞增殖和凋亡。

綜上所述，miR-568 在膠質母細胞瘤細胞系中表達下調，而AKR1B10 表達上調。上調miR-568 可通過靶向抑制AKR1B10 的表達阻礙膠質母細胞瘤細胞增殖，并促進細胞凋亡，miR-568/AKR1B10 軸有可能為膠質母細胞瘤的治療提供了新靶點。