南方鐮孢Fusarium meridionale特異性PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

王云飛 張昊 楊美欣 雒麗麗 徐進(jìn) 許景升 馮潔 陳萬權(quán)

摘要 為建立快速、穩(wěn)定的南方鐮孢Fusarium meridionale特異性檢測方法，對已報道的鐮孢屬reductase-like基因部分序列進(jìn)行比對分析，尋找特異性SNP位點(diǎn)，設(shè)計出特異性檢測引物F-Fm/R-Fm3。利用該引物對包括南方鐮孢在內(nèi)的30株鐮孢的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示僅在7株南方鐮孢中均擴(kuò)增出400 bp左右的特異性條帶。PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明該方法的檢測靈敏度達(dá)到500 pg基因組DNA。

關(guān)鍵詞 鐮孢屬; 特異性檢測; 南方鐮孢

中圖分類號： S432.44，S435

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020700

Abstract In order to establish a rapid and stable PCR detection method for Fusarium meridionale，the partial reductase-like gene sequences from F.meridionale were analyzed by alignment to screen specific SNPs and a pair of specific primer （F-Fm/R-Fm3） were designed according to the specific SNPs.?With the specific primers， the genomic DNAs of 30 strains from 21 Fusarium species， including Fusarium meridionale etc.， were amplified by PCR. The results revealed that a specific amplicon of approximately 400 bp was amplified from seven strains of F. meridionale， while no amplicon was amplified from other 23 control strains and their negative control groups. Moreover， the sensitivity of this method reached 500 pg genomic DNA.

Key words Fusarium; specific detection; Fusarium meridionale

在世界范圍內(nèi)鐮孢屬Fusarium真菌可以引起包括玉米、小麥、水稻等多種農(nóng)作物病害，不僅會造成農(nóng)作物產(chǎn)量損失，品質(zhì)降低，還會產(chǎn)生單端孢霉烯毒素等有毒次級代謝產(chǎn)物，對人和動物造成安全隱患，同時也會影響農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[15]。在我國由鐮孢引起的赤霉病、穗腐病在小麥、玉米產(chǎn)區(qū)的發(fā)生越來越頻繁，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，對我國主糧生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[6]。據(jù)Zhou等[7]報道在中國重慶地區(qū)采集的116個玉米穗和籽粒腐爛樣品中分離的鐮孢分離株中，南方鐮孢Fusarium meridionale被鑒定為主要真菌之一。據(jù)張昊等[8]報道南方鐮孢F.meridionale也是引起我國小麥赤霉病的病原菌之一。

目前鑒定南方鐮孢主要采用多位點(diǎn)基因分型法和EF1a基因序列分析法，但是這2種方法成本較高、耗時較長[913]。而特異性PCR檢測技術(shù)在真核生物的分類方面也有較好效果，相較于傳統(tǒng)的植物病原分類方法主觀、復(fù)雜，而且難以準(zhǔn)確地分析和鑒別近似種和種內(nèi)生理小種、致病型間的差異等不足之處，其具有快速、準(zhǔn)確、重演性好的優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)成為植物病原檢測的重要技術(shù)[1419]。鐮孢菌的某些基因序列，如reductase-like序列、EF序列等，在種內(nèi)菌株之間有較高的保守性，但在屬間和屬內(nèi)不同種間卻大不相同，有著豐富的多態(tài)性，常用于鐮孢菌系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用這一性質(zhì)設(shè)計特異性引物來進(jìn)行分子檢測是目前被廣泛接受的一種技術(shù)[2022]。本研究的目的在于設(shè)計F.meridionale種的特異性PCR擴(kuò)增引物，利用分子檢測方法，更高效準(zhǔn)確地鑒定該鐮孢種，用以監(jiān)測該種的種群分布及動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

30株供試菌株相關(guān)信息見表1。

1.2 鐮孢菌基因組DNA的提取

刮取適量菌絲于2 mL滅菌離心管中，真空冷凍抽干24 h后加入一個玻璃珠和適量石英砂在MiniBeadbeater-96研磨儀中研磨90 s。使用OMEGA公司的真菌基因組DNA提取試劑盒D3390-02提取DNA。

1.3 特異性PCR引物的設(shè)計

利用Geneious 11.0.4軟件對GenBank中已報道的包括南方鐮孢在內(nèi)的多種鐮孢菌的reductase-like基因序列 （GenBank登錄號見表1）進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)南方鐮孢在序列的第802位存在一個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) （SNP）（圖1）。根據(jù)該SNP位點(diǎn)，利用Primer Premier 5設(shè)計特異性PCR引物F-Fm/R-Fm1。為了提高引物特異性，在反向引物中引入錯配位點(diǎn)，將反向引物3′端第3位堿基（與比對序列的第804位互補(bǔ)）C分別替換為T、G、A，形成反向引物R-Fm2、R-Fm3和R-Fm4，用于特異性篩選。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 PCR反應(yīng)體系與程序

PCR反應(yīng)體系 （25 μL）：DNA模板1 μL， 10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，無菌水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min;10℃保存。

1.5 引物特異性檢驗(yàn)

以表1中所列參照菌株進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，用設(shè)計的特異性PCR引物F-Fm/R-Fm1、F-Fm/R-Fm2、F-Fm/R-Fm3、F-Fm/R-Fm4分別進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序同1.4，其中181506、181571、181513、181514為本實(shí)驗(yàn)室采集分離并已經(jīng)通過TEF1α基因序列分析鑒定為南方鐮孢。超純水代替基因組DNA為模板設(shè)為陰性對照，用1.2%瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)合結(jié)果選擇最優(yōu)引物進(jìn)行引物靈敏度檢驗(yàn)。

1.6 引物靈敏度檢驗(yàn)

利用核酸濃度測定儀（GE公司，NanoVue Plus）將提取到的南方鐮孢基因組DNA按照10倍稀釋梯度，由5 ng/μL依次稀釋至5 fg/μL，然后利用步驟1.5中篩選的引物對7個濃度基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以水為陰性對照，用1%瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性PCR引物

根據(jù)Geneious軟件中Fusarium spp.的reductase-like基因序列的比對分析結(jié)果，設(shè)計了用于南方鐮孢檢測的特異性PCR引物F-Fm/R-Fm1、F-Fm/R-Fm2、F-Fm/R-Fm3、F-Fm/R-Fm4（表2），根據(jù)引物設(shè)計可知，目的片段為400 bp左右。

2.2 引物特異性檢驗(yàn)

以表1中菌株的基因組DNA為模板，利用設(shè)計的4對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測結(jié)果如圖2所示，所有引物均可從南方鐮孢基因組DNA中擴(kuò)增出一條大小為400 bp左右的清晰電泳條帶。但未引入錯配堿基的引物F-Fm/R-Fm1在F.mesoamericanum、銳頂鐮孢F.acuminatum、擬輪枝鐮孢F.verticillioides、早熟禾鐮孢F.poae、F.langsethiae、彎角鐮孢F.camptoceras的基因組DNA中擴(kuò)增出其他非特異性條帶（圖2a）。引入錯配堿基T的引物F-Fm/R-Fm2在F.acaciae-mearnsii的基因組DNA中擴(kuò)增出其他非特異性條帶（圖2b）。引入錯配堿基A的引物F-Fm/R-Fm4在銳頂鐮孢的基因組DNA中擴(kuò)增出其他非特異性條帶（圖2d）。引入錯配堿基G的引物F-Fm/R-Fm3，除南方鐮孢基因組DNA外，其他菌株的基因組DNA均未擴(kuò)增出任何片段（圖2c）。特異性檢測結(jié)果顯示，引物F-Fm/R-Fm3具有最優(yōu)的種間特異性，能夠區(qū)分南方鐮孢與Fusarium 屬內(nèi)其他菌株。

2.3 引物靈敏性檢驗(yàn)

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物條帶亮度隨模板濃度降低而變暗，模板量為500 pg時還能分辨出1條約400 bp的特異性條帶（圖3），而模板量小于500 pg時電泳條帶消失，同時無菌水對照組均無電泳條帶產(chǎn)生，說明該引物的靈敏度為500 pg。

3 討論

植物病原真菌的準(zhǔn)確鑒定和早期檢測是植物病害防治的關(guān)鍵，目前PCR分子檢測技術(shù)在植物真菌病害鑒定過程中得到越來越廣泛的應(yīng)用，曹月霞等[18]設(shè)計了兩對特異性引物W106R/W106S和FOW-4F/FOW-4R，建立了一個雙重PCR體系，能夠準(zhǔn)確、快速檢測出尖孢鐮孢菌西瓜專化型Fusarium oxysporum f.sp.niveum。Yang等[19]根據(jù)CTPS2和TEF1α基因內(nèi)的SNPs，設(shè)計了2套復(fù)合引物，能夠在一個PCR反應(yīng)內(nèi)鑒定出禾谷鐮孢F.graminearum和亞洲鐮孢F.asiaticum。Suzuki等[17]根據(jù)tri6和tri3基因設(shè)計了8條引物，在一個反應(yīng)內(nèi)能同時鑒定出F.graminearum與 F.asiaticum及二者的毒素類型。目前已知鐮孢屬真菌包含多個復(fù)合種，以禾谷鐮刀菌復(fù)合種Fusarium graminearum species complex （FGSC）為例，現(xiàn)階段研究表明其中至少包含16個種，若僅僅利用形態(tài)學(xué)方法很難將其全部區(qū)分開來，潘逸等[6]利用PCR分子檢測技術(shù)，設(shè)計了布什鐮孢F.boothii的特異性引物，在包含全部FGSC在內(nèi)的28個鐮孢種中僅F.boothii產(chǎn)生特異性條帶，且靈敏度高，可以有效鑒定該種。因此PCR檢測技術(shù)用于鐮孢屬物種的鑒定是很有必要的。

Reductase-like基因常用于鐮孢菌系統(tǒng)進(jìn)化分析，其序列在鐮孢種內(nèi)十分保守[23]。本研究通過序列比對，發(fā)現(xiàn)F.meridionale中reductase-like基因存在穩(wěn)定的特異性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)?？衫迷撐稽c(diǎn)開發(fā)特異性檢測引物。常規(guī)PCR技術(shù)檢測單個堿基差異存在特異性較差的問題。吳亞君等[24]研究顯示，引物3′端堿基錯配對非特異性擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生有顯著影響，3′端單一堿基錯配可較大程度地降低非特異性擴(kuò)增的發(fā)生，但同時也降低了擴(kuò)增效率造成靈敏度下降。Wu等[25]提出了一種評價引物擴(kuò)增能力的方法，其將引物中特定位置堿基替換成其余3種堿基后得到一系列新引物，新引物再與模板進(jìn)行非特異性擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)堿基錯配位置對PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率有較大影響，其中3′端3-4位錯配對擴(kuò)增效率沒有顯著影響。Birdsell等[26]研究發(fā)現(xiàn)在引物設(shè)計過程中，在引物3′端第3位設(shè)計錯配堿基可以有效減少非特異性擴(kuò)增。

李金春等[27]以錯配反應(yīng)與正常反應(yīng)之間的ΔCt值為指示，發(fā)現(xiàn)堿基錯配種類對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的非特異性擴(kuò)增有顯著影響，并呈現(xiàn)出較強(qiáng)的規(guī)律性。黃可[28]在對臨床上18S rRNA序列同源性較高的巴貝斯蟲Babesia spp.以及泰勒蟲Theileris spp.進(jìn)行分子區(qū)分時發(fā)現(xiàn)，引物3′端堿基由C變?yōu)锳，以及由G變?yōu)镃時，擴(kuò)增效率最差。由T變?yōu)镃以及由A變?yōu)镃時，擴(kuò)增效率最好。為減少本試驗(yàn)中非特異性擴(kuò)增條帶的產(chǎn)生，增強(qiáng)引物的特異性，本研究在特異性引物設(shè)計過程中，將其3′端第3個堿基C分別替換為T、G、A形成錯配堿基，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示引物中錯配堿基可以有效減少非特異性擴(kuò)增條帶的產(chǎn)生，且不同錯配堿基影響不同，其中堿基C替換為堿基G對非特異性擴(kuò)增的抑制作用要優(yōu)于替換為堿基A、T。與黃可的試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是由于所鑒定物種不同，針對不同堿基對非特異性擴(kuò)增的影響還有待進(jìn)一步深入研究。

本研究利用Geneious、Primer Premier 5等軟件進(jìn)行比較分析，設(shè)計合成了1對用于檢測南方鐮孢的特異性PCR引物F-Fm/R-Fm3。并利用包括標(biāo)準(zhǔn)菌株在內(nèi)的30株鐮孢菌菌株基因組DNA對該引物進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示：在所有檢測的基因組DNA中僅僅從南方鐮孢基因組DNA中擴(kuò)增出400 bp的特異性條帶，從而證明F-Fm/R-Fm3引物對于南方鐮孢的基因組DNA具有穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確鑒定該菌種，相對于測序等方法，其低成本的特點(diǎn)適用于其大規(guī)模群體組成鑒定。

參考文獻(xiàn)

[1] 蘭靜， 金海濤， 趙琳， 等. 玉米真菌毒素污染與控制技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全， 2020（5）： 1521.

[2] YLI-MATTILA T， GAGKAEYA T， WARD T J， et al. A novel Asian clade within the Fusarium graminearum species complex includes a newly discovered cereal head blight pathogen from the Russian Far East [J]. Mycologia， 2009， 101（6）： 841852.

[3] MOREIRA G A， NICOLLI C P， GOMES L B， et al. Nationwide survey reveals high diversity of Fusarium species and related mycotoxins in Brazilian rice： 2014 and 2015 harvests [J/OL]. Food Control， 2020， 113： 107171. DOI： 10.1016/j.foodcont.2020.107171.

[4] DONG Fei， XU Jianhong， ZHANG Xiao， et al. Gramineous weeds near paddy fields are alternative hosts for the Fusarium graminearum species complex that causes Fusarium head blight in rice [J]. Plant Pathology， 2020， 69（3）： 433441.

[5] KHEDHER S B， MEIDOUB-TRABELSI B， TOUNSI S. Biological potential of Bacillus subtilis V26 for the control of Fusarium wilt and tuber dry rot on potato caused by Fusarium species and the promotion of plant growth [J/OL]. Biological Control， 2021， 152： 104444. DOI： 10.1016/j.biocontrol.2020.104444.

[6] 潘逸， 張昊， 羅文， 等. Fusarium boothii特異性PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 植物保護(hù)， 2015， 41（4）： 121124.

[7] ZHOU Danni， WANG Xiaoming， CHEN Guokang， et al. The major Fusarium species causing maize ear and kernel rot and their toxigenicity in Chongqing， China [J/OL]. Toxins， 2018， 10（2）： 90. DOI： 10.3390/toxins10020090.

[8] 張昊. 中國麥類赤霉病菌群體遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2011.

[9] 王裕中， 米勒. 中國小麥赤霉病菌優(yōu)勢種——禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒素能力的研究[J]. 真菌學(xué)報， 1994 13（3）： 229234.

[10]MACHADO F J， NICOLLI C P， MLLER P A， et al. Differential triazole sensitivity among members of the Fusarium graminearum species complex infecting barley grains in Brazil [J]. Tropical Plant Pathology， 2017， 42（3）： 197202.

[11]CASTANARES E， DINOLFO M I， DEL PONTE E M， et al. Species composition and genetic structure of Fusarium graminearum species complex populations affecting the main barley growing regions of South America [J]. Plant Pathology， 2016， 65（6）： 930939.

[12]單柳穎. 引起玉米莖腐病的鐮孢菌的分離鑒定與多樣性分析[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2018.

[13]CHANG Xiaoli， YAN Li， NAEEM M， et al. Maize/soybean relay strip intercropping reduces the occurrence of Fusarium root rot and changes the diversity of the pathogenic Fusarium species [J/OL]. Pathogens， 2020， 9（3）： 211. DOI： 10.3390/pathogens9030211.

[14]李菊芬， 林濤， 馬國斌. 甜瓜種子細(xì)菌性果斑病菌PCR檢測方法的研究[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2020， 36（2）： 7781.

[15]張鴻， 劉中華， 林志堅， 等. 甘薯薯瘟病菌特異性PCR快速檢測方法[J].江蘇師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2019， 37（4）： 3741.

[16]鐘鑫， 趙靜， 吳曉蕾， 等. 西瓜枯萎病菌PCR分子檢測方法研究[J]. 果樹學(xué)報， 2019， 36（12）： 17711779.

[17]SUZUKI F， KOBA A， NAKAJIMA T. Simultaneous identification of species and trichothecene chemotypes of Fusarium asiaticum and F.graminearum sensu stricto by multiplex PCR [J]. Journal of General Plant Pathology， 2010， 76（1）： 3136.

[18]曹月霞， 凌鍵， 謝丙炎. 西瓜枯萎病菌的快速檢測與鑒定[J]. 生物技術(shù)通報， 2015， 31（7）： 5863.

[19]YANG L， VAN DER LEE T， YANG X， et al. Fusarium populations on Chinese barley show a dramatic gradient in mycotoxin profiles [J]. Phytopathology， 2008， 98（6）： 719727.

[20]CHIOTTA M L， ALANIZA ZANON M S， PALAZZINI J M， et al. Fusarium graminearum species complex occurrence on soybean and F.graminearum sensu stricto inoculum maintenance on residues in soybean-wheat rotation under field conditions [J]. Journal of Applied Microbiology， 2021， 130（1）： 208216.

[21]HAFEZ M， ABDELMAGID A， ADAM L R， et al. Specific detection and identification of Fusarium graminearum sensu stricto using a PCR-RFLP tool and specific primers targeting the translational elongation factor 1α gene [J]. Plant Disease， 2020， 104（4）： 10761086.

[22]王娜， 馬雅軍， 王喆之， 等. PCR相關(guān)技術(shù)方法在植物病害檢測中的應(yīng)用（綜述）[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2004， 20（4）： 112115.

[23]GIMENO A， SOHLBERG E， PAKULA T， et al. TaqMan qPCR for quantification of Clonostachys rosea used as a biological control agent against Fusarium graminearum [J/OL]. Frontiers in Microbiology， 2019， 10： 1627. DOI： 10.3389/fmicb.2019.01627.

[24]吳亞君， 王斌， 劉鳴暢， 等. 阿膠中馬和驢成分的實(shí)時熒光PCR檢測[J]. 食品科學(xué)， 2014， 35（8）： 8588.

[25]WU J H， HONG P Y， LIU W T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension [J]. Journal of Microbiological Methods， 2009， 77（3）： 267275.

[26]BIRDSELL D N， PEARSON T， PRICE E P， et al. Melt analysis of mismatch amplification mutation assays （Melt-MAMA）： a functional study of a cost-effective SNP genotyping assay in bacterial models [J/OL]. PLoS ONE， 2017， 7（3）： e32866. DOI： 10.1371/journal.pone.0032866.

[27]李金春， 李家鵬， 周彤， 等. 引物3′端不同堿基錯配情況下實(shí)時熒光定量PCR非特異性擴(kuò)增的發(fā)生規(guī)律[J]. 食品科學(xué)， 2017， 38（10）： 277283.

[28]黃可. 引物和探針核苷酸錯配對PCR靈敏度和特異性影響的研究[D]. 揚(yáng)州： 揚(yáng)州大學(xué)， 2017.

（責(zé)任編輯：楊明麗）