3種藥劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲卵及2齡幼蟲的影響

楊雪婷 楊紫薇 丁曉帆

摘要 為了篩選對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲Meloidogyne enterolobii防治效果好的藥劑，本文采用浸蟲法分別測(cè)試了3%阿維菌素微乳劑、41.70%氟吡菌酰胺懸浮劑及20%噻唑膦水乳劑不同濃度、不同處理時(shí)間對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲的致死作用，以及對(duì)卵孵化和卵胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明，3%阿維菌素微乳劑對(duì)2齡幼蟲致死作用最強(qiáng)，LC50僅為0.017 mg/L，對(duì)卵孵化抑制作用最好，0.16 mg/L處理24 h抑制率達(dá)到100%;41.70%氟吡菌酰胺懸浮劑次之，對(duì)2齡幼蟲LC50為0.310 mg/L，2.5 mg/L處理24 h卵孵化抑制率為92.47%;20%噻唑膦水乳劑最差，對(duì)2齡幼蟲LC50為4.209 mg/L，3.125 mg/L處理24 h卵孵化抑制率僅為65.54%;3種藥劑均能影響象耳豆根結(jié)線蟲卵胚胎發(fā)育，隨著藥劑濃度、處理時(shí)間的增加，死亡卵比例逐漸增高，且藥劑處理使多數(shù)卵胚胎停止在單細(xì)胞和1齡幼蟲階段。綜上，3種供試藥劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲均有較好的抑殺作用，抑殺效果依次為3%阿維菌素微乳劑>41.70%氟吡菌酰胺懸浮劑>20%噻唑膦水乳劑。研究結(jié)果將為更好地防治象耳豆根結(jié)線蟲提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 象耳豆根結(jié)線蟲; 生物測(cè)定; 殺線蟲劑

中圖分類號(hào)： S482.51

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021064

Abstract In order to screen effective nematicides， the effects of abamectin 3% ME， fluopyram 41.70% SC and fosthiazate 20% EW on the embryonic development， egg hatching and juvenile mortality of Meloidogyne enterolobii were determined by dipping method with different concentrations of these nematicides. The results showed that abamectin 3% ME showed the best toxicity to the second stage juveniles （J2） with the lowest LC50 value of 0.017 mg/L， and eggs hatching inhibition rate reached 100% treated by 0.16 mg/L of abamectin 3% ME within 24 hours. Fluopyram 41.70% SC was the next， with LC50 value of 0.310 mg/L， and inhibition rate reached 92.47% treated by 2.5 mg/L. While the toxicity of fosthiazate was the lowest， with LC50 value of 4.209 mg/L and 65.54% inhibition rate treated by 3.125 mg/L. All three nematicides could affect the embryonic development. The proportion of dead eggs was positively correlated with nematicides concentration and treated time. The nematicides made most embryos suspend at the stage of single cell and first stage juveniles. These results demonstrated that three tested nematicides have certain inhibitory effects on eggs and J2 of M.enterolobii， and the inhibitory effect was abamectin 3% ME>fluopyram 41.70% SC>fosthiazate 20% EW in order. The above results will provide a theoretical basis for better control of M.enterolobii.

Key words Meloidogyne enterolobii; bioassay; chemical nematicide

海南省是中國(guó)重要的熱帶作物和反季節(jié)瓜果蔬菜生產(chǎn)基地[1]，作物種類繁多，連作栽培普遍，使土傳病害逐年加重，其中根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.病害尤為嚴(yán)重。根結(jié)線蟲危害蔬菜根部，在幼根、須根上形成根結(jié)，重病植株矮小，葉片發(fā)黃，呈點(diǎn)片缺肥狀，不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)不良[24]。近些年來，象耳豆根結(jié)線蟲M.enterolobii已成為危害海南當(dāng)?shù)毓瞎卟说膬?yōu)勢(shì)種群，單一檢出率達(dá)到62.37%，與南方根結(jié)線蟲復(fù)合侵染檢出率為8.47%[56]，與其他主要根結(jié)線蟲不同的是，象耳豆根結(jié)線蟲能克服Mi、N和Rk等抗線蟲基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)，能在抗性番茄、辣椒等茄果蔬菜上寄生繁殖，造成產(chǎn)量損失[79]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，根結(jié)線蟲病害發(fā)生后，最嚴(yán)重田塊減產(chǎn)可達(dá)到70%以上，其危害程度已經(jīng)超過真菌，成為第二大植物病害[10]。

目前，根結(jié)線蟲的防治仍以化學(xué)防治為主，且多數(shù)以南方根結(jié)線蟲為作用對(duì)象開展藥劑防效、作用機(jī)理等研究[1116]，而化學(xué)藥劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲卵和幼蟲的作用研究報(bào)道較少。本研究以象耳豆根結(jié)線蟲為靶標(biāo)，測(cè)定市場(chǎng)上3種常見殺線藥劑3%阿維菌素微乳劑、41.70%氟吡菌酰胺懸浮劑及20%噻唑膦水乳劑對(duì)其卵孵化、卵胚胎發(fā)育以及2齡幼蟲的抑殺作用，以期為象耳豆根結(jié)線蟲防治提供更加有效的方法。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

3%阿維菌素微乳劑（ME），海南利蒙特生物農(nóng)藥有限公司;41.70%氟吡菌酰胺懸浮劑（SC），拜耳作物科學(xué)（中國(guó)）有限公司;20%噻唑膦水乳劑（EW），佛山市高明區(qū)萬邦生物有限公司。

1.2 象耳豆根結(jié)線蟲單卵粒及2齡幼蟲懸浮液的準(zhǔn)備

根結(jié)線蟲采自海南樂東黃秋葵病根，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為象耳豆根結(jié)線蟲，利用番茄苗進(jìn)行單卵塊純化擴(kuò)大培養(yǎng)，60 d后收集病根，洗去病根表面的土壤，挑取2份卵囊，一份用0.5%的NaClO表面消毒3 min，滅菌水沖洗3次，收集卵粒制備成卵懸浮液用于卵孵化和卵胚胎發(fā)育試驗(yàn)[17]。將另一份卵囊放在便攜式線蟲孵化裝置中[18]，于28℃恒溫箱中孵化，每2～3 d收集孵化的2齡幼蟲，備用。

1.3 3種藥劑對(duì)2齡幼蟲的毒力測(cè)定

根據(jù)初篩試驗(yàn)將3種供試藥劑分別稀釋成5個(gè)不同濃度的藥液（表1），采用李秋捷等[19]的浸蟲法測(cè)定藥劑對(duì)2齡幼蟲的毒力，取1 mL（100條/mL） 2齡幼蟲懸浮液置于24孔細(xì)胞板（6×4）中，加入等體積的供試藥劑，使其有效成分濃度為最終測(cè)試濃度;每個(gè)濃度重復(fù)3次，并設(shè)滅菌水對(duì)照（CK）。所有處理置于（25±0.5）℃恒溫箱中，24 h后記錄死亡蟲數(shù)、存活蟲數(shù)，計(jì)算死亡率和校正死亡率，計(jì)算LC50及95%置信區(qū)間。

死亡率=死亡線蟲數(shù)處理線蟲數(shù)×100%;

校正死亡率=處理死亡率-對(duì)照死亡率1-對(duì)照死亡率×100%。

1.4 3種藥劑對(duì)卵孵化的抑制

3種供試藥劑的濃度同1.3小節(jié)。采用浸蟲法[20]并略有改動(dòng)。各取1 mL藥液加到24孔細(xì)胞板中，每孔分別加入卵懸浮液1 mL（100粒/mL）。每處理重復(fù)3次，設(shè)清水對(duì)照（CK）。在25℃條件下處理2、4、8、16、24 h后，卵粒沉積在24孔細(xì)胞板底部，用移液槍吸出藥液并置換成滅菌水，（25±0.5）℃培養(yǎng)箱孵育，5 d后在體視顯微鏡下檢查卵的孵化情況，計(jì)算孵化抑制率。

孵化抑制率=對(duì)照孵化率-處理孵化率對(duì)照孵化率×100%。

1.5 3種藥劑對(duì)卵胚胎發(fā)育的影響

將3種供試藥劑分別稀釋成3個(gè)不同濃度，3%阿維菌素ME濃度為0.02、0.08、0.32 mg/L;41.70%氟吡菌酰胺SC濃度為0.312 5、1.25、5 mg/L;20%噻唑膦EW濃度為3.125、12.5、50 mg/L。將1.2小節(jié)制備的卵懸液稀釋成50粒/100 μL，取100 μL卵懸浮液置于凹玻片上，分別加入等體積的供試藥劑，使其有效成分為最終測(cè)試濃度，每處理3次重復(fù)，設(shè)滅菌水對(duì)照（CK）。將含藥卵凹玻片置于線蟲卵胚胎發(fā)育保濕培養(yǎng)裝置中[21]，25℃孵育，16 h后將藥液吸出，置換成滅菌水后繼續(xù)25℃保濕孵育，每隔12 h于顯微鏡下觀察記錄處于不同發(fā)育階段的卵胚胎數(shù)及發(fā)育狀態(tài)[22]，持續(xù)觀察144 h。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel、Origin處理和SPSS 26軟件進(jìn)行方差分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種藥劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲的毒力測(cè)定

藥劑處理24 h后，3種藥劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲的生物活性均較高（表2），其中3%阿維菌素ME對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲的LC50僅為0.017 mg/L;41.70%氟吡菌酰胺SC次之，LC50為0.310 mg/L;而20%噻唑膦EW LC50為4.209 mg/L。3%阿維菌素ME和41.70%氟吡菌酰胺SC的毒力分別是20%噻唑膦EW的247.59倍和13.58倍，表明象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲對(duì)阿維菌素更敏感，結(jié)合其極低的LC50，表明阿維菌素對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲致死作用最強(qiáng)。

2.2 3種藥劑對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲卵孵化的影響

3種藥劑不同濃度處理對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲卵孵化均有抑制作用，隨著處理時(shí)間和藥劑濃度的增加，各藥劑對(duì)線蟲卵孵化的抑制率增加;3%阿維菌素ME對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲卵孵化的抑制效果最好，0.16 mg/L處理8 h的抑制率為88.79%，24 h的抑制率達(dá)到100%;41.7%氟吡菌酰胺SC次之，2.5 mg/L處理8 h和16 h的抑制率分別為66.98%和73.09%，24 h 后達(dá)到92.47%;20%噻唑膦EW稍差，3.125 mg/L處理24 h抑制率僅為65.54%，而高濃度25 mg/L處理8 h和16 h的孵化抑制率分別為76.60%和84.63%，24 h后達(dá)到95.57%（圖1）。

2.3 3種藥劑處理對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲卵胚胎發(fā)育的影響

象耳豆根結(jié)線蟲正常發(fā)育的卵內(nèi)含物清晰可辨（圖2a～f），而停止發(fā)育的死亡卵內(nèi)含物模糊，細(xì)胞處于離析降解狀態(tài)（圖2g～h）。隨著藥劑濃度的增高，死亡卵的比例相應(yīng)增加，在處理144 h后，3%阿維菌素ME 0.16 mg/L、41.7%氟吡菌酰胺SC 2.5 mg/L、20%噻唑膦EW 25 mg/L處理組的死亡卵比例分別為54.03%、51.33%、55.05%，與對(duì)照組死亡卵比例（11.27%）相比有明顯差異;各處理組卵胚胎發(fā)育多數(shù)停止在單細(xì)胞和1齡幼蟲期階段，正常孵化的2齡幼蟲比例隨著藥劑濃度的增加逐漸減少，3個(gè)供試藥劑孵出2齡幼蟲比例均小于12.14%，而對(duì)照組2齡幼蟲期比例高達(dá)53.76%。

隨著藥劑處理后孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，在12～144 h內(nèi)單細(xì)胞卵態(tài)逐漸減少，在144 h時(shí)，3%阿維菌素ME 0.16 mg/L、41.7%氟吡菌酰胺SC 2.5 mg/L、20%噻唑膦EW 25 mg/L處理單細(xì)胞卵比例分別為14.97%、17.50%、13.39%，均明顯高于對(duì)照組的5.20%;死亡卵、1齡幼蟲期則隨著孵育時(shí)間的推移逐漸增加;而原腸期卵態(tài)比例平均在96 h達(dá)到最大，3%阿維菌素ME 0.01 mg/L、41.7%氟吡菌酰胺SC 0.156 3 mg/L、20%噻唑膦EW 1.562 5 mg/L處理分別高達(dá)25.45%、19.49%、23.28%;隨著時(shí)間推移，原腸期卵態(tài)比例逐漸減少，上述3個(gè)藥劑處理組僅為2.10%、1.92%、0.00%（圖3～5）。

3 討論

根結(jié)線蟲不同種類、不同群體對(duì)藥劑存在受藥反應(yīng)差異。本研究中，3種供試藥劑均對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲卵和2齡幼蟲有較強(qiáng)的抑殺作用，3%阿維菌素ME、41.7%氟吡菌酰胺SC、20%噻唑膦EW對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲的LC50分別僅為0.017、0.310、4.209 mg/L;而已有研究表明，1.8%阿維菌素EC、41.70%氟吡菌酰胺SC、75%噻唑膦EC對(duì)南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲的LC50分別為1.62、0.33、55.54 mg/L[19， 2425]，均明顯高于對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲的LC50，說明象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲對(duì)3種藥劑更敏感，其中3%阿維菌素ME殺線效果最好。

鄒雅新等[26]報(bào)道90%阿維菌素TC 5 mg/L處理24 h對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化抑制率僅為82.57%;漆永紅等[17]和賢振華等[27]采用浸蟲法測(cè)得3%阿維菌素EC 10 mg/L處理8 h對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化抑制率為80.9%、10%噻唑膦GR 25 mg/L處理16 h抑制率為83.6%;本試驗(yàn)中，3%阿維菌素ME 0.16 mg/L處理8 h抑制率為88.79%，24 h高達(dá)100%，表明在相同處理時(shí)間下，對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲卵孵化的抑制僅需較低的藥劑濃度，即可達(dá)到與較高藥劑濃度對(duì)南方根結(jié)線蟲相似的效果，進(jìn)一步表明根結(jié)線蟲不同種類之間存在對(duì)藥劑的受藥敏感性差異。同時(shí)，各地區(qū)試驗(yàn)結(jié)果存在差異的另一個(gè)原因可能是由于各省市、地區(qū)之間用藥習(xí)慣不同，比如藥劑選擇、施藥劑量及藥劑輪換上的差異等，導(dǎo)致各地根結(jié)線蟲種群在耐藥性方面存在差異。因此，在準(zhǔn)確診斷各地發(fā)生根結(jié)線蟲種類的基礎(chǔ)上，可通過室內(nèi)篩選對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲具有較高抑殺活性的藥劑，從而為降低化學(xué)農(nóng)藥用量、更好地制定象耳豆根結(jié)線蟲防治策略提供依據(jù)。

鄒雅新等[28]研究發(fā)現(xiàn)卵的孵化具有異質(zhì)性，部分卵可能由于外界環(huán)境的變化仍處于滯育狀態(tài)。而在本研究藥劑對(duì)卵孵化和卵胚胎發(fā)育的抑制作用中，未能在測(cè)定時(shí)間內(nèi)孵化的卵是受藥劑抑制完全不能孵化，還是由于逆境出現(xiàn)滯育仍需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：田 喆）